SS-56, nowy komórkowy cel odpowiedzi autoprzeciwciał w zespole Sjögrena i układowym toczniu rumieniowatym czesc 4

Poziom przeciwciał w surowicach pacjentów HIV-1 był również porównywany z poziomami obecnymi w surowicach 32 zdrowych osób, które były dopasowane do płci (osiem kobiet i 24 mężczyzn) oraz dopasowany wiek (średnia: 38 lat, zakres: 26. 66 lat) z grupą pacjentów. Wykrywanie autoAb metodą ELISA. Standardowy test przeprowadzono jak opisano wcześniej (29). W skrócie, płytki do mikromiareczkowania powlekano przez 3 godziny w 4 ° C z .g / ml każdego z białek rSSA-52, rSSA-60, rSSA-48 i rSS-56. Po płukaniach w PBS zawierającym 0,05% Tween 20, płytki inkubowano przez 2 godziny z różnymi rozcieńczeniami surowic (1: 100. 1: 2700) od wszystkich badanych osobników. Płytki przemyto i inkubowano przez noc w temperaturze 4 ° C ze skoniugowanym z peroksydazą przeciwludzkim IgG (Sigma-Aldrich). Po odkryciu przez substrat dichlorowodorku O-fenylenodiaminy (Sigma-Aldrich) i H2O2 odczytano wartości absorbancji przy długości fali 492 nm przy użyciu automatycznego czytnika mikropłytek (Titertek Multiskan, Labsystems, Helsinki, Finlandia). Wyniki przedstawiono jako wartości absorbancji odpowiadające rozcieńczeniu (1: 900 dla pacjentów SS i SLE, 1: 300 dla pacjentów z HIV), które dało odczyty w fazie liniowej krzywej wiązania przeciwciała. Wyniki Charakterystyka molekularna cDNA SS-56. Aby uzyskać cDNA pełnej długości SS-56, najpierw próbowaliśmy przeskanować bibliotekę cDNA leukocytów ze zidentyfikowanym fragmentem cDNA w analizie różnicowej wyświetlacza. Próby te nie zakończyły się sukcesem; w związku z tym zmieniliśmy naszą strategię na serię kolejnych 5 (3 – i 3 (3-RACE przy użyciu specyficznych oligonukleotydów. Próby te wytworzyły znacznie dłuższy i kompletny cDNA o 3331 bp, zawierający pojedynczą otwartą ramkę odczytu i kodujący białko o 485 aminokwasach i przewidywanym Mr wynoszącym 56 kDa. Sekwencja flankująca pierwszy kodon ATG jest w ścisłej zgodności z konsensusową sekwencją eukariotycznego Kozaka dla kodonu inicjacji metioniny (30). Po regionie kodującym następuje długi 3. nieulegający translacji region zawierający sygnał poliadenylacji i krótki odcinek poli (A). Analiza sekwencji aa (fig. 1) ujawniła obecność palca RING (aa 16. 60) -B box (aa 98. 120), zwiniętej cewki (aa 227. 248) (RBCC) (31). Wyszukiwanie podobieństw w bazie danych GenBank ujawniło 66% homologii i 43% identyczności nowego białka z ludzkim Ro / SSA-52, członkiem rodziny białek RBCC (Figura 1). Z powodu tego podobieństwa w sekwencji i poniżej opisanego profilu biologicznego, nowe białko 56-kDa zostało nazwane SS-56. Potwierdzenie wielkości cDNA SS-56 o pełnej długości i analizę ekspresji tkankowej nowego genu przeprowadzono za pomocą analizy Northern blot. We wszystkich tkankach wykryto prążek około 4 kb, a wysoką ekspresję odnotowano w śledzionie i wątrobie płodowej (Figura 2). Figura Porównanie sekwencji aminokwasowych SS-56 i SSA-52. Identyczna sekwencja aminokwasowa jest oznaczona wielką literą; substytucja konserwatywna w reszcie aminokwasowej (+). Domena palców RING została podkreślona, B box (bogata w Cys / His) jest podwójnie podkreślona, a region Leucine Zipper podkreślony jest przerywanymi liniami. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe zostały przesłane do GenBank pod numerem dostępu AF360739. Figura 2. Analiza Northern blot ekspresji mRNA SS-56 w prawidłowych tkankach ludzkich. Liczne bloty tkanki (ścieżka 1, śledziona, ścieżka 2, węzeł chłonny, ścieżka 3, grasica, ścieżka 4, leukocytoza krwi obwodowej, ścieżka 5, szpik kostny, ścieżka 6, wątroba płodowa) hybrydyzowano ze specyficznymi oligonukleotydami dla SS-56 (góra ) lub z cDNA p-aktyny (dół), jak opisano w Methods. Charakterystyka immunologiczna SS-56. CDNA SS-56 subklonowano do wektora pQE80, a rSS-56, połączony z resztami 6-histydyny, oczyszczono na żywicy Ni-NTA. Białko to zastosowano do immunizacji myszy. Przy użyciu testu ELISA uzyskano, że otrzymane surowice odpornościowe mają wysokie miana i swoiste przeciwciała poliklonalne anty-SS-56. Analiza Western blot z użyciem surowicy odpornościowej myszy wykazała prążek 58 kDa i dwa mniejsze produkty degradacji rSS-56 (Figura 3a). Te same surowice odpornościowe rozpoznały również natywne białko, w ekstraktach z różnych linii komórkowych, jako pojedyncze pasmo 63 kDa (Figura 3b). Większy rozmiar natywnego białka, w porównaniu z rekombinowanym, może być wynikiem nieprawidłowej migracji w SDS-PAGE. Ponadto, preinkubacja mysich surowic odpornościowych z nadmiarem rSS-56 całkowicie zniosła wykrywanie natywnego białka (Figura 3c). Z drugiej strony, próby immunoprecypitacji natywnego białka z ekstraktów komórkowych, z użyciem antysurowicy anty-SS-56 związanej z białkiem G Sepharose, nie zakończyły się powodzeniem. Taką trudność w immunoprecypitacji natywnego białka opisano również w przypadku SSA-52 i można to wytłumaczyć niskim poziomem ekspresji danego białka (32).
[hasła pokrewne: enterococcus faecalis w moczu, kariotyp osoby z zespołem downa, pijalnia wódki i piwa kraków ]
[przypisy: pijalnia wódki i piwa kraków, trufla kraków, nova krova ]