SS-56, nowy komórkowy cel odpowiedzi autoprzeciwciał w zespole Sjögrena i układowym toczniu rumieniowatym cd

Całkowite ekstrakty komórkowe, przygotowane w buforze do lizy (10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40, mM EDTA i 0,5 mM PMSF), a rekombinowane białka frakcjonowano za pomocą elektroforezy 12% SDS / PAGE, poddano elektrotranslacji na błonach nitrocelulozowych i inkubowano przez godzinę z surowicą odpornościową człowieka (rozcieńczenie 1:50) lub myszką (rozcieńczenie 1: 100). Po przepłukaniu membrany sondowano rozcieńczeniem 1: 500 koenzymu peroksydazy chrzanowej sprzężonego z kozim przeciwciałem przeciwko mysim lub antyludzkim Ig (Sigma-Aldrich). Reaktywne prążki zostały następnie ujawnione przez zastosowanie układu substratu 4CN peroksydazy (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA) lub odczynników ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Pośrednia analiza immunofluorescencyjna. Komórki HeLa hodowane w szkiełkach komorowych (Nalge Nunc, Rochester, New York, USA) utrwalano i permeabilizowano za pomocą oziębionego lodem metanolu / acetonu (2: obj./obj.) Przez 10 minut w ~ 20 ° C. Po namaczaniu w PBS zawierającym 1% BSA przez 30 minut, szkiełka inkubowano z pierwszym przeciwciałem (poliklonalną mysią anty-SS-56 lub przed immunizowaną surowicą mysią) w temperaturze pokojowej przez 45 minut w PBS zawierającym 0,5% BSA. Po przemyciu PBS, szkiełka barwiono kozim anty-mysim IgG skoniugowanym z FITC, a następnie inkubowano przez 3 minuty w PBS zawierającym 0,5 .g / ml jodku propidyny przed badaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Lokalizacja SS-56 przez przejściową transfekcję. CDNA SS-56 subklonowano do wektora pEGFP (CLONTECH), który pozwala na ekspresję SS-56 połączonego z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Komórki HeLa przejściowo transfekowano plazmidem pEGFP-SS-56 z zastosowaniem odczynnika do transfekcji Effectene (QIAGEN). Lokalizację SS-56 analizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wiązanie białka SS-56 z DNA. Białko rSS-56 wytwarzane w E. coli zastosowano w teście wiązania DNA, jak opisano w innym miejscu (15). W skrócie, wysycającą ilość DNA z komórek HeLa pozwolono związać w temperaturze pokojowej żywicy DEAE-Sephadex (Amersham Pharmacia Biotech) w buforze wiążącym (75 mM NaCl, 20 mM bufor fosforanowy [pH 7,4]). Białko rSS-56 inkubowano następnie przez 30 minut z DNA, a związane białko eluowano wzrastającymi stężeniami NaCl w 40 mM buforze fosforanowym (pH 6,7). Eluaty rozdzielono za pomocą SDS-PAGE i analizowano metodą Western blot. Immunoprecypitacja. Komórki HeLa znakowano radioaktywnie przez noc metioniną [35S], a lizat komórkowy przygotowywano w buforze do lizy (10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40, mM EDTA i 0,5 mM PMSF). . Surowicę od normalnych myszy (6 ul) inkubowano przez godzinę na lodzie z 2 x 106 cpm wyznakowanego radioaktywnie ekstraktu komórkowego przed dodaniem 40 .l kulek białka G Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech). Po godzinie rotacji w 4 ° C, dodano 25 ul anty-SS-56 lub normalnej surowicy myszy do supernatantu i inkubowano przez godzinę na lodzie. Peletki z białkiem G Sepharose dodano następnie w końcowej objętości 400 ul buforu do lizy i inkubowano przez godzinę w 4 ° C z ciągłą rotacją. Kulki z sefarozą przemyto 10 razy buforem do lizy, a znakowane radioaktywnie białka, które wytrąciły się z Sepharose, analizowano na 12% SDS-PAGE, a następnie autoradiografię. Pacjenci. Dwudziestu pięciu pacjentów z pierwotnymi SS i 22 pacjentami z SLE byli w Uniwersyteckim Centrum Szpitalnym w Lille, Francja. Rozpoznanie każdej choroby opierało się na rutynowych parametrach klinicznych i laboratoryjnych oraz, w przypadku SS, na obecności co najmniej czterech elementów ze zmodyfikowanych kryteriów europejskich (28). Zastosowanie techniki podwójnej immunodyfuzji Ouchterlony (ID) do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom SSA i SSB (3) przeprowadzono w laboratorium diagnostycznym Uniwersyteckiego Centrum Szpitalnego. Trzynaście pacjentów z SS i 12 SLE zostało zgłoszonych jako negatywne dla przeciwciał SSA i SSB. Pacjenci z SS mieli 19 kobiet i 6 mężczyzn w średnim wieku (. SD) 53. 16 lat, podczas gdy pacjenci z SLE (21 kobiet i jeden mężczyzna) byli znacząco młodsi (P = 0,0174), ze średnią wieku 42 lat. 17 lat. Grupę zdrowych osób kontrolnych (20 kobiet i pięciu mężczyzn, średni wiek 45. 14 lat), która była porównywana pod względem wieku i płci z obiema grupami pacjentów, włączono do porównawczej oceny poziomów autoAb. Ponadto, grupa 32 osób zakażonych HIV-1c została przetestowana przed i po leczeniu silnymi lekami przeciwretrowirusowymi. Grupa ta była w Departamencie Chorób Zakaźnych w Hospital Centro Tourcoing we Francji i składała się z ośmiu kobiet i 24 mężczyzn w średnim wieku 37 lat (zakres: 25. 64 lata). Przed rozpoczęciem leczenia przeciwretrowirusowego średnie obciążenie wirusowe osocza wyniosło 421,326 kopii / ml, a średnia. SE liczby CD4 było 150. 4 komórki /. L. Po średnim czasie trwania 14 miesięcy leczenia dwoma inhibitorami RT i jednym inhibitorem proteazy, obciążenia wirusowe spadły do mediany 3,272 kopii / ml, a liczba CD4 wzrosła do 313. 23 komórki /. L
[przypisy: skierowanie do szpitala psychiatrycznego, kariotyp osoby z zespołem downa, nadczynność tarczycy leki ]
[więcej w: genji sushi, królestwo pierożka, pompon komis ]