SS-56, nowy komórkowy cel odpowiedzi autoprzeciwciał w zespole Sjögrena i układowym toczniu rumieniowatym ad

Jednak wśród genów, które uległy zróżnicowanej ekspresji przez Murabutide, sklonowaliśmy pełnej długości cDNA jednego nowego genu, który nie wykazywał identyczności z opublikowanymi sekwencjami genów. Odpowiednia sekwencja aminokwasów (aa) ujawniła białko o przewidywanym Mr wynoszącym 56 kDa i wykazujące silne podobieństwo do Ro / SSA-52. To białko, nazwane SS-56, okazało się być celem odpowiedzi autoimmunologicznych u pacjentów z zakażeniem SS, SLE i HIV-1. Co ważne, autoAb. S do SS-56 wykryto w surowicach od dużego odsetka pacjentów z SS i SLE, którzy byli ujemni zarówno dla przeciwciał SSA, jak i SSB. Dlatego SS-56 reprezentuje nowego członka rodziny autoantygenów SS (autoAg. S) i może mieć istotne znaczenie dla diagnozy pewnych zaburzeń autoimmunologicznych. Metody Hodowle komórkowe i odczynniki. Linie komórkowe HeLa, U937, Jurkat i Molt4 utrzymywano w RPMI 1640 uzupełnionym 10% FCS, 8 ug / ml siarczanu gentamycyny (Shering-Plough, Levalois-Perret, Francja) i 2 mM glutaminy (Life Technologies-Invitrogen, Cergy-Pontoise, Paryż). Klonowanie cDNA SS-56. Fragment cDNA o długości 152 bp, który nie ulegał ekspresji w traktowanym Murabutidem, w porównaniu z nieleczonymi PBMC zubożonym w CD8 od pacjenta zakażonego HIV-1 (3 izolowano z różnicowych żelów do wyświetlania. Fragment 152-cDNA z wyświetlacza różnicowego znakowano radioizotopem a- [32P] dCTP, stosując zestaw do znakowania Megaprime (Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, Francja), i stosowano do przeszukiwania biblioteki cDNA leukocytów. TriplEx według producenta. S instrukcje (CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, Kalifornia, USA). Do syntezy końców 5. I 3. CDNA użyto zestawu SMART Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) (CLONTECH). Aby wytworzyć 5. -End, zastosowano cztery kolejne i specyficzne startery oligonukleotydów: (a) 5a-AATGCGTTTATTTCT-CCAGTTTGGCCTATTTAA-3 .; (b) 5a-AACTCTGCAATCATCCTCCACAGGA-3; (c) 5a-CTGGCTCTGCTGGATGAGCTCGCTATG-3; i (d) 5a-TCAGCCCCATTCCTGGAT-GTA-3 .. 3 -koniec cDNA SS-56 amplifikowano za pomocą następującego startera: 5 -CCTGTCTGAGGCATAGAGGCAGGCAAGCCG-3 .. Pełnej długości cDNA kodujący SS-56 otrzymano następnie za pomocą RT-PCR, stosując dwa syntetyczne oligonukleotydy, które zawierały kodon start dla 5 -końca i kodon stop dla 3 -końca. Wszystkie produkty amplifikacji PCR wklonowano do wektora pCR2.1 (TOPO TA Cloning, Life Technologies-Invitrogen), a sekwencje nukleotydowe określono w obu niciach, stosując sekwencjonowanie terminatora barwnika i sekwenator DNA ABI 377 wyposażony w ABI Prism Model wersja 2.1.1. oprogramowanie do rejestracji i analizy danych (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). Zarówno sekwencje nukleotydowe jak i wydedukowane aa analizowano pod kątem podobieństwa ze znanymi sekwencjami przy użyciu BLAST (27) i narzędzi do proteomiki ExPASy (ExPASy, Genewa, Szwajcaria). Początkowy fragment cDNA o różnicowej ekspozycji odpowiadał nukleotydom 3152. 3304 w pełnej sekwencji cDNA SS-56 przedłożonej do GenBank (numer dostępu AF360739). Analiza Northern blot. Tkanka Northern biot wielu tkanek została zakupiona od firmy CLONTECH i została zhybrydyzowana z cDNA SS-56 znakowanym a-[32P] dCTP zgodnie z instrukcjami producenta. Ten sam blot następnie odpędzono i poddano rehybrydyzacji z sondą p-aktynową w celu standaryzacji pod względem równoważności RNA. Ekspresja białka His-Tagged i produkcja mysiego przeciwciała poliklonalnego. CDNA SS-56 subklonowano do wektora pQE-80 (QIAGEN, Courteboeuf, Francja) i użyto do transformacji TOP 10F. Escherichia coli (Life Technologies-Invitrogen). CDNA SSA-52, SSA-60 i SSB-48 subklonowano do wektora pET28 (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) i stosowano do transformacji E. coli XL1-niebieski. Oczyszczanie rekombinowanych białek połączonych z sześcioma histydyną przeprowadzono za pomocą chromatografii powinowactwa Ni2 + zgodnie z instrukcjami producenta (QIAGEN). Końcową elucję prowadzono w 8 M moczniku, 0,1 M NaH2PO4 i 0,01 M Tris-Cl (pH 4,5). Oczyszczone rekombinowane białka przechowywano w równych objętościach w temperaturze <70 ° C. W celu przygotowania przeciwciała poliklonalnego, 6-tygodniowe samice myszy BALB / c (Iffa-credo, l. Arbresle, Francja) immunizowano dootrzewnowo 50. G rekombinowanego SS-56 (rSS-56) zemulgowanego w CFA (Sigma-Aldrich). , Saint Quentin Fallavier, Francja). Po 30 dniach myszy stymulowano 50 .g tego samego rSS-56 emulgowanego w niekompletnym adiuwancie Freunda (Sigma-Aldrich). Piętnaście dni później wszystkim myszom podano dodatkowy zastrzyk z taką samą ilością rSS-56, ale bez adiuwantu. Surowice zbierano 10 dni po ostatnim doładowaniu i testowano na poziomy przeciwciała anty-SS-56. Przed immunizacją zebrano surowice od tej samej myszy i zastosowano jako kontrole negatywne. Western blot [podobne: kariotyp osoby z zespołem downa, pompon komis, deccoria galerie ] [patrz też: papryczki 5, motochemia, deccoria galerie ]