Sekwencja PEST w ABCA1 reguluje degradację przez proteazę kalpainy i stabilizację ABCA1 przez apoA-I czesc 4

Laktacystyna, specyficzny inhibitor degradacji proteasomalnej, powodował podobne 1,4- do 1,5-krotne zwiększenie poziomu delecji typu PET typu dzikiego i PEST, oraz 1,8- i 2,4-krotny wzrost odpowiednich ubikwitynowanych postaci. Podobne obserwacje przeprowadzono w trzech oddzielnych eksperymentach. Chociaż ubikwitynacja i proteasomalna degradacja ABCA1, ubikwitynacja ABCA1 nie jest kontrolowana przez sekwencję PEST (Figura 1h). W degradacji ABCA1 zależnej od PEST pośredniczy proteina kalpainy. W kilku przypadkach sekwencje PEST zostały zaangażowane w proteolizę białek błonowych przez kalpeny, pomagając związać te proteazy z ich celami (21, 24). Podobnie jak w ostatnim raporcie (19), stwierdziliśmy, że obrót białka ABCA1 został zmniejszony przez tiolowe inhibitory proteazy: ALLN, MG132, leupeptynę i E64 (nie pokazano). Jednak te inhibitory są niespecyficzne i nie różnicują różnych klas proteaz tiolowych. Aby zobaczyć, czy ABCA1 może być specyficznie celowany przez kalpany, potraktowaliśmy komórki specyficznym inhibitorem proteazy kalpainy – calpeptyną (25). W rezultacie uzyskano wynik 2,8. 0,3-krotny wzrost (n = 8 P <0,001) w całkowitym poziomie białka ABCA1 (Figura 2a) i 3,7. 0,4-krotny wzrost (P = 0,005) na powierzchni komórek ABCA1 (Figura 2b). Wpływ calpeptyny na ABCA1 w lizatach komórkowych został zniesiony przez delecję sekwencji PEST (Figura 2a). Co więcej, podobny czterokrotny wzrost powierzchni komórkowej ABCA1 obserwowano po traktowaniu kalpeptyną lub delecji sekwencji PEST i nie obserwowano wpływu calpeptyny na poziomy mutanta delecyjnego PEST na powierzchni komórki (Figura 2b). Te eksperymenty sugerują, że ABCA1 jest celem proteolizy kalpainy i że sekwencja PEST pomaga kierować kalpainę na powierzchnię komórek ABCA1. Figura 2 Proteaza kocapinowa katalizuje zależną od PEST degradację ABCA1. (a) Poziomy ABCA1 i ABCA1delPEST w komórkach 293, inkubowane z lub bez calpeptyny (30 .g / ml) przez 3 godziny, jak określono za pomocą analizy Western blot. (b) Powierzchnię komórek ABCA1 lub ABCA1delPEST w komórkach 293 z inkubacją lub bez inkubacji z kalpeptyną (20 .g / ml) przez 3 godziny, co określono na podstawie biotynylacji, immunoprecypitacji przeciwciałem anty-FLAG i analizą Western z peroksydazą chrzanową awidyny. Dane są reprezentatywne dla dwóch eksperymentów, każdy przeprowadzony w trzech powtórzeniach, z podobnymi wynikami. (c i d) Podatność na egzogenną dodaną cp-kalibrację ABCA1 lub ABCA1delPEST metabolicznie znakowaną przez [35S] metioninę w permeabilizowanych digitoninie 293 komórkach z (d) lub bez (c) wstępnym traktowaniem apoA-I (10 ug / ml ) Przez 3 godziny. Aby potwierdzić rolę kalpainy w degradacji ABCA1 i zaangażowanie sekwencji PEST, komórki permeabilizowano, przemyto, a następnie potraktowano oczyszczoną proteazą p-cispainy, powszechnie wyrażanym podtypem proteaz kalpainy. W przypadku ABCA1 typu dzikiego, leczenie to skutkowało wydajną degradacją (Figura 2c). Jednakże nie zaobserwowano znaczącej degradacji ABCA1delPEST (Figura 2c), dostarczając bezpośrednich dowodów, że zależna od PEST degradacja ABCA1 jest mediowana przez proteazę kalpainową. Aby sprawdzić, czy proteina kalpainy degraduje również ABCA1 w bardziej fizjologicznych warunkach (tj. Bez nadekspresji ABCA1 przez transfekcję komórkową), traktowaliśmy pierwotne hodowle miejscowych makrofagów otrzewnowych myszy lub pierwotne hepatocyty myszy kalpeptyną. Spowodowało to również wzrost poziomu białka ABCA1 (Fig. 3, aib, dla makrofagów, ABCA1 był zwiększony o 3,02 a 1,12-krotnie, P <0,05, dla 20 (ig / ml calpeptyny, dla hepatocytów, ABCA1 był zwiększony o 2,29. 0,27-krotnie, P <0,05, przy 15 (ag / ml calpeptyny); nie było znaczącej zmiany w mRNA ABCA1 (nie pokazano). Wyniki te wskazują, że proteaza kalpainy jest fizjologicznym regulatorem obrotu białka ABCA1. Figura 3Calpeptyna zwiększa ABCA1 w pierwotnych mysich makrofagach i hepatocytach. Poziomy ABCA1 w makrofagach otrzewnowych myszy (a) lub pierwotnych hepatocytach myszy (b) inkubowane z lub bez calpeptyny we wskazanym stężeniu przez 3 godziny. Dane są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów z podobnymi wynikami. Związany z ApoA-I wzrost ABCA1 jest spowodowany przez hamowanie degradacji kalpainy ABCA1. ABCA1 wiąże się i sieciuje apoA-I (14, 18), podnosząc możliwość, że apoA-I może modulować obrót ABCA1. ApoA-I zwiększał poziomy białka ABCA1 w transfekowanych komórkach 293 (figura 4a), dając w wyniku maksymalną cztero- do pięciokrotną indukcję ABCA1 w stężeniach 10 a 20 ug / ml po 2-4 godzinach inkubacji. Te stężenia ubogiego w lipidy apoA-I prawdopodobnie występują w limfie i płynie śródmiąższowym (26) [hasła pokrewne: enterococcus faecalis w moczu, węglowodany złożone tabela, grudziądz jednostka wojskowa ] [więcej w: nova krova, pod norenami, spaghetteria kobierzyńska ]