Sekwencja PEST w ABCA1 reguluje degradację przez proteazę kalpainy i stabilizację ABCA1 przez apoA-I cd

Następnie komórki poddano lizie przez dodanie ml buforu RIPA z 40 .g / ml calpeptyny. Znakowane FLAG ABCA1 poddano immunoprecypitacji za pomocą kulek agarozowych anty-FLAG i poddano analizie ilościowej przez PhosphorImager. Pierwotne hepatocyty. Hepatocyty izolowano według Honkakoskiego i Negishi (20), z tym wyjątkiem, że kompletny inhibitor proteazy dodano do buforu do trawienia zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Molecular Biochemicals). Infuzja Apolipoproteiny AI u myszy. Wszystkie myszy stosowane w tych badaniach były 8-tygodniowymi samicami myszy typu dzikiego wsobnego szczepu C57BL / 6J i karmiono je karmą dla dzieci. Myszy znieczulono dootrzewnowo 0,1 ml / 30 g masy ciała roztworu zawierającego 100 mg / ml ketaminy i 30 mg / ml ksylazyny. ApoA-I (20 mg / kg masy ciała) lub BSA jako kontrolę podawano przez żyłę udową jako zastrzyk bolusa. Cztery godziny po wstrzyknięciu zwierzęta uśmiercono, a wątrobę wycięto do analizy. Wyniki Sekwencja PEST w ABCA1 moduluje degradację ABCA1. Stosując znakowanie metaboliczne w transfekowanych komórkach 293, wykazaliśmy, że białko ABCA1 obraca się gwałtownie, z okresem półtrwania wynoszącym około godzinę (nie pokazano). Wiele białek, które przechodzą szybki obrót, zawiera sekwencje wzbogacone w prolinę, kwas glutaminowy, serynę i treoninę, zwane sekwencjami PEST (21). Korzystając z programu PESTfind (22), zidentyfikowaliśmy zachowaną potencjalną sekwencję PEST w ABCA1 (figura 1a, wynik PEST, + 16,42; wyniki PEST większe niż +5 są uważane za znaczące). W celu oceny roli sekwencji PEST eksprymowaliśmy znakowany FLAG mutant delecyjny PEST (ABCA1delPEST) w 293 komórkach. Jak wykazano przez biotynylację i immunoprecypitację, poziomy powierzchni komórkowej ABCA1delPEST były znacznie zwiększone w porównaniu z ABCA1 typu dzikiego (Figura 1b, góra, średni wzrost krotności 3,9. 0,4, n = 4, P <0,001). Przeciwnie, całkowite poziomy ekspresji ABCA1delPEST w lizatach komórkowych były nieco niższe niż ABCA1 typu dzikiego (Figura 1b, dół), odzwierciedlając obniżoną szybkość syntezy mutanta delecyjnego (70% typu dzikiego, jak określono przez puls metaboliczny -znakowanie za pomocą [35S] metioniny). Aby ocenić działanie ABCA1delPEST, zmierzono komórkowe wiązanie się apoA-I i fosfolipidu i cholesterolu do APoA-I. Wszystkie parametry były zwiększone dla mutanta ABCA1delPEST w porównaniu z ABCA1 typu dzikiego (Figura 1, c, f i g). Po normalizacji poziomów ekspresji białka w lizatach komórkowych (Figura 1d), ABCA1delPEST wykazał dwu- do czterokrotny wzrost wypływu cholesterolu (Figura 1e). Efekt był większy przy niższych poziomach transfekcji DNA (Figura 1e), co sugeruje istnienie nieznanego czynnika ograniczającego szybkość regulującego metabolizm ABCA1 za pośrednictwem PEST. Tak więc, delecja sekwencji PEST powoduje zwiększenie stężenia ABCA1 na powierzchni komórki, przy proporcjonalnym wzroście aktywności funkcjonalnej. Odkrycia te wskazują, że sekwencja PEST odgrywa kluczową rolę w określaniu ekspresji funkcjonalnego ABCA1 na powierzchni komórki i sugeruje, że główna aktywna postać ABCA1 znajduje się na powierzchni komórki. Figura Sekwencja PEST reguluje ekspresję powierzchni komórki i funkcję ABCA1. (a) Schematyczny model ABCA1 pokazujący lokalizację i sekwencję aminokwasową sekwencji PEST u myszy (m), człowieka (h) i kurczaka (c). Wynik PEST wynosi + 16,42, jak określono za pomocą PESTfind. (b) Poziomy całkowitej (dolnej) i powierzchni komórki (górnej, biotynylowanej) ABCA1 i ABCA1delPEST w przejściowo transfekowanych komórkach HEK293. (c, f i g) zależny od dawki zależny od ABCA1 i komórkowy wypływ cholesterolu z udziałem ABCA1delPEST (c), fosfolipidowy odpływ (f) i połączenie z komórkami apoA-I (g). (d) Całkowitą komórkową masę białka ABCA1 określoną przez ilościową analizę Western blot w teście wypływu cholesterolu. (e) Wydajność wypływu cholesterolu określona na podstawie procentowego wypływu znormalizowanego dla całkowitej masy komórkowej białka ABCA1. (h) Poziomy całkowitego (na dole) i ubikwitynowanego (na górze) ABCA1 i ABCA1delPEST w komórkach HEK293 inkubowanych z lub bez laktacystyny (20 .M) przez 3 godziny. Dane są reprezentatywne dla dwóch eksperymentów (c i e6h, trzykrotne, d, zduplikowane) lub trzech eksperymentów (b, duplikat i trzykrotny) z podobnymi wynikami. Sekwencje PEST w białkach błony komórkowej często zwiększają obroty białka przez zwiększenie wiązania ligazy ubikwityny, co prowadzi do ubikwitynacji, endocytozy i proteasomalnej degradacji docelowej cząsteczki (23). Stwierdziliśmy, że ABCA1 był ubikwitynowany (rysunek 1h) i początkowo uznano za możliwą rolę sekwencji PEST w pośredniczeniu tego efektu. Jednakże delecję typu PEST i PEST ABCA1 ubikwitynowano na podobnych poziomach [podobne: operacje plastyczne piersi, fishing24, skierowanie do szpitala psychiatrycznego ] [hasła pokrewne: pompon komis, pijalnia wódki i piwa kraków, trufla kraków ]