Sekwencja PEST w ABCA1 reguluje degradację przez proteazę kalpainy i stabilizację ABCA1 przez apoA-I ad

Oczyszczone P-kalcypina, calpeptyna, laktacystyna i N-Ac-Leu-Leu-norleucin (ALLN) pochodziły z Calbiochem-Novabiochem Corp. (San Diego, Kalifornia, USA). Konstrukty plazmidów i transfekcja komórek. ABCA1-FLAG skonstruowano zgodnie z opisem (14). ABCA1delPEST został oparty na ABCA1-FLAG. Za pomocą PCR skonstruowaliśmy ABCA1delPEST przez usunięcie sekwencji nukleotydowej, która koduje mysie aminokwasy ABCA1 1283. 1306 i potwierdzono ją przez sekwencjonowanie. Komórki HEK293, w 12- lub 24-studzienkowych płytkach pokrytych kolagenem, przejściowo transfekowano różnymi konstruktami plazmidów we wskazanych stężeniach DNA za pomocą Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., San Diego, California, USA) w 37 ° C przez noc (. 20 godzin ). Rutynowo stosowaliśmy konstrukt eksprymujący zielone białko fluorescencyjne (GFP) do wizualnego monitorowania skuteczności transfekcji (tj. Odsetka komórek wyrażających GFP). Wydajność transfekcji 293 komórek mieściła się w zakresie 50-80% komórek. Chociaż wydajność transfekcji różniła się w zależności od eksperymentu, okazało się, że zmienność w ramach tego samego eksperymentu była niewielka (ogólnie mniej niż 10%). Oprócz wykonywania wielu powtórzeń w każdym eksperymencie, powtórzyliśmy wszystkie eksperymenty w wielu różnych okazjach, aby potwierdzić powtarzalność wyników. Komórkowe testy usuwania lipidów, asocjacja komórek apoA-I i chemiczne sieciowanie. Testy przeprowadzono jak w ref. 14. Ogólnie komórki 293 znakowano przez hodowanie przez noc w pożywce zawierającej albo [3H] cholesterol, na wypływ cholesterolu, albo [3H] cholinę, na wypływ fosfolipidów. Następnego dnia komórki zostały przemyte świeżą pożywką przed lub po traktowaniu, jak wskazano, a następnie apoA-I dodano jako akceptor i inkubowano przez wskazany okres przed pobraniem pożywki i komórek do analizy. Myszowe komórki makrofagów otrzewnowych izolowano od samców myszy za pomocą płukania otrzewnowego za pomocą PBS 3 dni po iniekcji dootrzewnowej ml 3,85% tioglikolanu. Komórki znakowano mCi / ml [3H] cholesterolu przez noc w DMEM i 0,2% BSA uzupełnionym 50. G / ml acetylowanego LDL plus ligandy LXR / RXR 22 (R) -hydroksycholesterol i kwas 9-cis retinowy (oba 10. M). Po znakowaniu komórki przemyto i przeprowadzono wypływ z 10 .g / ml apoA-I przez 3 godziny. Następnie komórki i pożywkę zebrano do analizy. Wydzielenie cholesterolu wyrażono jako procent radioaktywności uwalnianej z komórek do pożywki, w stosunku do całkowitej radioaktywności w komórkach plus pożywka. W przypadku połączenia komórek apoA-I komórki inkubowano z 0,2 .g / ml [125I] apoA-I w 0,2% BSA i DMEM przez godzinę w 37 ° C. Po trzykrotnym przemyciu świeżą pożywką, komórki poddano lizie za pomocą 0,1% SDS i 0,1N NaOH buforu do lizy, a radioaktywność oznaczono za pomocą licznika gamma. Immunoprecypitacja i analiza immunoblot ABCA1. Do analizy immunoblot ABCA1, ABCA1-FLAG i ABCA1delPEST-FLAG, transfekowane komórki HEK293, makrofagi otrzewnowe lub pierwotne hepatocyty zostały przemyte i zeskrobane w PBS i poddane lizie w buforze RIPA (10 mM Tris-HCl [pH 7,3], mM MgCl2 , 1,0% Nonidet P-40, 0,5% deoksycholanu sodu i 5 mM EDTA w obecności inhibitorów proteazy jak następuje: 0,5 .g / ml leupeptyny, .g / ml aprotyniny i .g / ml pepstatyny A) ( Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA). Poposiłkowe supernatanty zawierające wskazane ilości białka poddano analizie Western z użyciem surowicy odpornościowej anty-ABCA1 lub przeciwciała anty-FLAG M2 i wykrywania chemiluminescencyjnego. Względne intensywności pasm zostały określone przez densytometrię. W celu analizy ABCA na powierzchni komórki, komórki najpierw biotynylowano za pomocą 0,5 mg / ml EZ-Link Sulfo-NHS-SS-biotyna (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) w 4 ° C przez 30 minut. Następnie komórki lizowano buforem RIPA w temperaturze 4 ° C. Po odwirowaniu supernatant lizatów komórkowych inkubowano z perełkami agarozowymi anty-FLAG przez noc w 4 ° C. Po odwirowaniu i przemyciu, zebrane perełki agarozowe poddano buforowi do próbek SDS-PAGE za pomocą 100 mM 2-merkaptoetanolu. Całkowity lub ubikwitynowany ABCA1 wykryto metodą Western blot przy użyciu albo przeciwciała anty-FLAG albo peroksydazy chrzanowej streptawidyny. Katalizowana przez Calpain proteoliza metabolicznie znakowanego ABCA1. Transfekcyjnie transfekowane komórki 293 znakowano pulsem za pomocą [35S] metioniny (0,5 mCi / ml) w 0,2% BSA i DMEM przez 2 godziny. Komórki przemyto trzy razy świeżą pożywką i umieszczono na lodzie na 10 minut. Następnie komórki permeabilizowano przez dodanie 80 | ig / ml digitoniny w DMEM i inkubowano na lodzie przez 15 minut. Następnie komórki przemyto dwukrotnie świeżą pożywką DMEM, a następnie oczyszczono P-kalibraż w DMEM plus 2 mM CaCl2 we wskazanym stężeniu i inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
[przypisy: biustonosz sportowy nike, sos brokułowy do makaronu, maseczka na włosy z siemienia lnianego ]
[hasła pokrewne: deccoria galerie, genji sushi, królestwo pierożka ]