Sekwencja PEST w ABCA1 reguluje degradację przez proteazę kalpainy i stabilizację ABCA1 przez apoA-I ad 6

Przeciwnie, podobnie jak ABCA1 typu dzikiego, calpeptyna znacząco zwiększała poziomy ABCA1-W590S (Figura 5c). Te wyniki sugerują, że wiązanie apoA-I jest wymagane, ale niewystarczające do wywołania stabilizacji ABCA1. Dodatkowe sygnały po związaniu apoA-I z ABCA1 są niezbędne do późniejszego hamowania degradacji kalpainy. ApoA-I i apoE zwiększają ABCA1 w pierwotnych makrofagach i hepatocytach. ABCA1 wiąże inne apolipoproteiny oprócz apoA-I (31). Aby sprawdzić, czy wpływ na ABCA1 to apoA-I. lub specyficzne dla makrofagów, badaliśmy wpływ apoA-I i apoE w pierwotnych hodowlach mysich makrofagów i hepatocytów. ApoA-I indukował wyraźny wzrost poziomu ABCA1 w makrofagach pierwotnych (Figura 6a) i hepatocytach (Figura 6C). Wzrostowi ABCA1 w lizatach komórek makrofagów towarzyszył wzrost powierzchni komórek ABCA1 (Figura 6b). ApoA-I powodował stabilizację ABCA1 w świeżo izolowanych hepatocytach od myszy karmionych karmą (Fig. 6c), podczas gdy w pierwotnych makrofagach wymagana była regulacja w górę ekspresji ABCA1 przez wstępne traktowanie aktywatorami acetyl-LDL i LXR / RXR w celu zaobserwowania efektu apoA-I (figura 6d). Prawdopodobnie odzwierciedla to wyższą podstawową ekspresję ABCA1 w hepatocytach i jest zgodne z potranskrypcyjnym trybem regulacji. Figura 6ApoA-I i apoE zwiększają białko ABCA1 w pierwotnych hepatocytach i makrofagach myszy. (a) Przebieg czasowy działania apoA-I (10 .g / ml) na poziomy białka ABCA1 w mysich makrofagach otrzewnowych leczonych przez noc za pomocą 50 .g / ml ligandów acetyl-LDL i LXR / RXR 22 (R) -hydroksycholesterol i Kwas 9-cis retinowy (RA) (oba 10 (M). (b) Biotynylowane poziomy ABCA1 na powierzchni komórki w makrofagach po 3 godzinach inkubacji z 10 .g / ml apoA-I. (c) Poziomy ABCA1 w pierwotnych hepatocytach myszy inkubowane przez 3 godziny z 10 .g / ml apoA-I. (d) Wpływ apoA-I (10 .g / ml) na poziomy ABCA1 w makrofagach leczonych ligandami acetyl-LDL (AcLDL) i LXR / RXR lub bez nich. (e) Reakcja na dawkę efektu apoE3 (3 godziny inkubacji) na poziomy białka ABCA1 w makrofagach otrzewnowych myszy, uprzednio traktowanych acetyl-LDL, 22 (R) -hydroksycholesterolem i kwasem 9-cis-retinowym. (f) Poziomy ABCA1 w makrofagach otrzewnowych myszy po 3 godzinach inkubacji z apoE3 lub bez (10 .g / ml). (g) Poziomy białka ABCA1, W590S-ABCA1 i ABCA1delPEST w komórkach HEK293 po 3 godzinach inkubacji z apoE3 lub bez. Dane są reprezentatywne dla dwóch (a, b, ei) lub trzech (c, d, f) eksperymentów o podobnych wynikach. ApoE jest wydzielany przez makrofagi, a infuzja lub ekspresja apoE w makrofagach jest przeciwmiażdżycowa (32, 33). Inkubacja makrofagów za pomocą egzogennego apoE zwiększyła białko ABCA1 w makrofagach otrzewnowych myszy (Figura 6, e i f), podobnie jak w przypadku apoA-I. Ponadto, w transfekowanych komórkach 293, apoE zwiększało ABCA1 typu dzikiego, ale nie miało wpływu na ekspresję mutantów delecyjnych W590S lub PEST ABCA1 (Figura 6g), co wskazuje, że apoA-I i apoE regulują ABCA1 podobnymi mechanizmami. Infuzja ApoA-I zwiększa ABCA1 in vivo. W celu ustalenia, czy apoA-I może również zwiększać ABCA1 in vivo, wstrzyknęliśmy myszom dożylnie apoA-I. Doprowadziło to do indukcji białka ABCA1 w wątrobie i makrofagach otrzewnowych (Figura 7, aib). Efekty w wątrobie obserwowano u karmionych zwierząt, podczas gdy u makrofagów obserwowano po karmieniu wysokotłuszczową dietą wysokocholesterolową przez 7 dni. Infuzja ApoA-I nie zmieniała znacząco poziomów mRNA ABCA1 w wątrobie, co określono za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym z użyciem sondy TaqMan (nie pokazano). Badanie przebiegu w czasie infuzji apoA-I wykazało, że wzrost ABCA1 utrzymywał się przez 8 godzin, ale po 24 godzinach poziomy białka ABCA1 powróciły do linii podstawowej, prawdopodobnie odzwierciedlając szybki klirens apoA-I z osocza. Zmierzyliśmy również poziomy białka ABCA1 w wątrobie z transgenicznej apoA-I (n = 6 myszy na grupę) i myszy z nokautem apoA-I (n = 2 myszy) i nie stwierdziliśmy znaczącej różnicy w porównaniu z kontrolą (dla myszy typu dzikiego, średnia ABCA1 poziom znormalizowany do aktyny = 0,25. 0,14, dla transgenicznego apoA-I, średnia = 0,15. 0,03, P = 0,18), co sugeruje, że pewna forma przewlekłej adaptacji może wystąpić w wyniku ciągłej ekspresji. Figura 7 Wstrzyknięcie ApoA-I zwiększa białko ABCA1 w hepatocytach i makrofagach u myszy. (a) Poziomy wątrobowego ABCA1 u myszy 4 godziny po dożylnym wstrzyknięciu apoA-I (20 mg / kg masy ciała) lub albuminy jako kontroli (Ctr). Wykres słupkowy przedstawia kwantyfikację poziomów białka ABCA1 znormalizowanych względem P-aktyny (n = 5 dla każdej grupy, P <0,01). (b) Poziomy ABCA1 makrofagów u myszy 4 godziny po wstrzyknięciu apoA-I (n = 5 dla grupy apoA-I i n = 3 dla grupy kontrolnej, P <0,006). Dyskusja Niniejsze badanie ujawnia nowy sposób regulacji ABCA1 przez proteolizę kalpainy, która jest odwracana przez zewnątrzkomórkowy ligand apoA-I działający poprzez sekwencję PEST w ABCA1. [przypisy: fishing24, moja historia odchudzania, kariotyp osoby z zespołem downa ] [hasła pokrewne: cukiernia michalscy, centrum tanich podręczników, deli 8 ]