Sekwencja PEST w ABCA1 reguluje degradację przez proteazę kalpainy i stabilizację ABCA1 przez apoA-I ad 5

Odkrycia te są podobne do tych z niedawnego raportu wykorzystującego transformowane kultury makrofagów (19). Podobnie jak w tym raporcie, stwierdziliśmy, że stabilizacja białka ABCA1 przez apoA-I wystąpiła bez jakiejkolwiek zmiany w mRNA ABCA1 (nie pokazano). Figura 4 Wzrost ABCA1, w którym pośredniczy mediator ApoA-I, wymaga sekwencji PEST. (a) Efekt apoA-I w zależności od dawki (3 godziny inkubacji) w komórkach HEK293 transfekowanych ABCA1 typu dzikiego. (b) poziomy białka ABCA1 typu dzikiego i ABCA1delPEST po 3 godzinach inkubacji z apoA-I (10 .g / ml) w komórkach 293 przejściowo transfekowanych konstruktami znakowanymi FLAG, jak określono metodą Western blot z przeciwciałami FLAG. Dane są reprezentatywne dla trzech (a) lub dwóch (b) eksperymentów z podobnymi wynikami. Co ważne, zdolność ApoA-I do zwiększania białka ABCA1 w hodowanych komórkach obserwowano dla ABCA1 typu dzikiego, ale nie dla ABCA1delPEST (Figura 4b, 2,9-0,4-krotny wzrost dla typu dzikiego, n = 4, P <0,01; - 0,2-krotny wzrost dla ABCA1delPEST, n = 4, P = 0,87), nawet jeśli związany z apoA-I i pośredni odpływ lipidów w komórkach eksprymujących ABCA1delPEST (Figura 1). Sugeruje to, że w wyniku działania apoA-I na ekspresję ABCA1 pośredniczy sekwencja PEST. Ponadto, wstępne traktowanie komórek apoA-I zniosło zdolność kalpainy do pośredniczenia w proteolizie ABCA1 (Figura 2d), dostarczając bezpośrednich dowodów na związek działania apoA-I z proteolizą za pośrednictwem kalpainy. Traktowanie komórek apoA-I (z lub bez inhibitorów proteasomu) nie wpływa na poziomy ubikwitynacji ABCA1 (nie pokazano); to wykluczało zmniejszoną degradację proteasomalną jako mechanizm. Te wyniki sugerują, że dodanie apoA-I do komórek aktywuje pętlę sprzężenia zwrotnego, która prowadzi do zwiększonego poziomu białka ABCA1. Ten efekt wymaga sekwencji PEST w ABCA1 i jest zależny od zmniejszonej proteolizy ABCA1 przez proteazę kalpainy. Wiązanie ApoA-I jest wymagane do wzrostu ABCA1 za pośrednictwem apoA-I. Następnie przeprowadziliśmy eksperymenty mające na celu określenie mechanizmu, dzięki któremu apoA-I stabilizuje białko ABCA1. Odpowiedź na dawkę efektu apoA-I na poziomy ABCA1 (Figura 3a) i na wypływ cholesterolu (27) jest podobna, co wskazuje, że w działaniu apoA-I może pośredniczyć zwiększone wiązanie lub cholesterol lub fosfolipidowy wypływ. Aby ocenić rolę wypływu cholesterolu, komórki zostały pozbawione cholesterolu przez inkubację z cyklodekstryną, do poziomu podobnego do uzyskanego przez ekspresję ABCA1 (Figura 5a). Nie zaobserwowano jednak wzrostu poziomu ABCA1; to wykluczyło wypływ cholesterolu jako mechanizm. Również inkubacja z HDL2 (50 .g białka / ml), która zawiera apoA-I, ale nie oddziałuje z ABCA1 (28), nie wpływa na poziomy ABCA1, co sugeruje, że wymagana jest bezpośrednia interakcja z ABCA1. Mutacja cytoplazmatycznej sekwencji wiążącej ATP Walkera znosi komórkowe wiązanie apoA-I i fosfolipidu i cholesterolu (28, 29). W różnych eksperymentach mutant motywu Walker wykazał zmienne poziomy podstawowej ekspresji w porównaniu z typem dzikim, ale konsekwentnie nie wykazywał wzrostu poziomów białka ABCA1 po inkubacji z apoA-I (Figura 5b). Tak więc stabilizacja ABCA1 prawdopodobnie jest wtórna do wiązania apolipoproteiny i / lub fosfolipidowego wypływu. Rycina 5 Wpływ cholesterolu i fosfolipidowego wypływu na indukcję ABCA1 przez apoA-I. (a, do góry) poziom białka ABCA1 w makrofagach otrzewnowych myszy po 3 godzinach inkubacji z 10 .g / ml apoA-I lub 50 .g / ml HDL2 lub po wstępnym traktowaniu .M metylo-P-cyklodekstryny (M (CD)) przez 5 minut, aby zubożyć cholesterol, a następnie za pomocą środków kontrolnych na 3 godziny. (a, dół) Fosfolipid (Pl) i cholesterol (Ch) wypływ w makrofagach zabiegi podobne do tych w górnym panelu. (b) Poziom białka ABCA1-FLAG i zmutowanego Walkera (K939M) ABCA1-FLAG (ABCA1WM) po 3 godzinach inkubacji z apoA-I (10 .g / ml) w przejściowo transfekowanych komórkach 293. (c) Poziomy białka ABCA1-FLAG typu dzikiego i białka ABCA1-W590S-FLAG po 3 godzinach inkubacji z apoA-I (10 .g / ml) lub kalpeptyną (20 .g / ml) w 293 komórkach. Dane są reprezentatywne dla dwóch (aib) lub trzech (c) eksperymentów z podobnymi wynikami. Niedawne badania wykazały, że mutacja ABCA1, która powoduje chorobę Tangiera (W590S), powoduje umiarkowany wzrost wiązania apoA-I, ale wadliwy wypływ lipidów (30). Testowaliśmy ten zmutowany ABCA1 pod kątem jego odpowiedzi na apoA-I i kalpeptynę. Jak podano (30), ABCA1-W590S nie pośredniczył w wydzielaniu cholesterolu i fosfolipidów do apoA-I i wykazał nieznaczny wzrost wiązania apoA-I, gdy ulega ekspresji w komórkach 293 (nie pokazano). ApoA-I nie zwiększyło poziomów ABCA1-W590S w komórkach 293 (Figura 5c). Podobne wyniki uzyskano w trzech różnych doświadczeniach [hasła pokrewne: trufla kraków, biustonosz sportowy nike, najtańsze apteki internetowe ] [przypisy: decoria galerie, studio urody 11, vanilla komis ]