Rozszerzająca się depresja korowa aktywuje i podwyższa MMP-9 ad

W tym raporcie badaliśmy związek między CSD, aktywacją MMP i zmianami BBB. Zaobserwowaliśmy, że CSD powoduje przedłużoną aktywność MMP-9, która prowadzi do rozpadu BBB, powstawania obrzęków i przecieków naczyniowych, które mogą być zahamowane przez inhibitor MMP. Wyniki W porównaniu z wynikami u zwierząt poddanych znieczuleniu i kraniotomii, ale bez kontroli indukcji CSD (pozorowana), CSD zwiększyło poziomy MMP-9 w homogenatach kory mózgowej, co wykazano przez zymografię żelową żelatyny (Figura 1, A i B). Pasma odpowiadające aktywności żelatynolitycznej MMP-2 były widoczne w kontroli. zwierzęta, ale nie zmieniły się po CSD (n = 6 na grupę, z wyjątkiem n = 2 po 48 i 96 godzinach) (ryc. 1, A i C). Poziomy MMP-9 zwiększone u dwóch z sześciu zwierząt po 3 godzinach (nie pokazane), były konsekwentnie wyższe od 6 do 48 godzin (P <0,05) i zanikły o 96 godzin. Wszystkie próbki po 24 godzinach wykazywały dwa prążki MMP-9 (88 i 92 kDa), których masy cząsteczkowe odpowiadały żelatynowym proteazom, które pojawiły się na zymogramach żelowych kondycjonowanych pożywek z pierwotnych neuronów kory mózgowej szczurów i astrocytów inkubowanych z 100 nM octanu mirystynianu forbolu (PMA) dla 24 godziny (ryc. 1B). Obserwowaliśmy mRNA MMP-9 u zwierząt pozorowanych, co sugeruje możliwość konstytutywnej ekspresji MMP-9 i podwyższonej ekspresji w korze po CSD. Indukowaną ekspresję mRNA MMP-9 wykryto metodą RT-PCR (Figura 2; n = 3 na punkt czasowy) rozpoczynając godzinę po CSD, zgodną ze zmianami transkrypcyjnymi i innymi danymi wskazującymi na nową syntezę białka MMP-9 (Figura 1A). Rycina 1CSD powodowała zależne od czasu wzrosty poziomów MMP-9, co oceniono za pomocą zymografii żelatyny żelowej. Jednostronna CSD została wywołana przez ukłucie w korze czołowej, jak opisano (patrz Metody). (A) Aktywność żelatynolityczna MMP-9 była konsekwentnie wyższa po stronie CSD od 6 do 48 godzin i powracała do poziomów podstawowych przez 96 godzin. Masy cząsteczkowe obu prążków odpowiadały masom szczurzej MMP-9 (92 kDa i 88 kDa). (B) Porównanie odpowiedzi MMP-9 indukowanych przez CSD w porównaniu z MMP-9 w kondycjonowanych pożywkach z hodowli neuronów kory szczura (NC) i astrocytów (AC) inkubowanych ze 100 nM octanu mirystynianu forbolu (PMA) przez 24 godziny. Rekombinowane ludzkie rekombinowane MMP-9 (H) i rekombinowane mysie Myc-9 (M) o masie cząsteczkowej 92 kDa również załadowano jako markery masy cząsteczkowej. Pasma MMP-9 indukowane przez CSD po 24 godzinach pasowały do tych uzyskanych z hodowli neuronów i astrocytów. Ips, ipsilateral (CSD); Cont, contralateral (nie CSD). (C) Pomiary densytometryczne potwierdzają wzrost MMP-9 indukowany przez CSD. Konstytutywna ekspresja MMP-2 i aktywność nie zmieniły się po CSD i były wizualizowane również w fikcji. nCSD, nie CSD. * P <0,05 w porównaniu ze stroną przeciwną. Figura 2CSD wykazała ekspresję w górę mMPNA MMP-9 w korze gruszkowatej po 1, 3 i 6 godzinach. Gen porządkowy GAPDH pokazano dla porównania. MRNA MMP-9 ulegało konstytutywnej ekspresji w obu korze mózgowych od kontroli i kontralateralnie do CSD. Aby wykluczyć możliwość, że uraz (tj. Ukłucie igłą), a nie efekt CSD, zwiększone poziomy MMP, zastosowaliśmy bloker receptora NMDA i inhibitor CSD MK-801 miejscowo 15 minut przed CSD. MK-801 blokował CSD, a także hamował rozwój zwiększonego poziomu MMP-9 po 12 godzinach w tkankach oddalonych od igły (fig. 3A; n = 3). Wynik ten wyraźnie pokazał, że aktywność MMP-9 jest związana z propagacją CSD i jest mniej prawdopodobne, że będzie związana z urazem stosowanym do jej zainicjowania. Figura 3 Bloker receptora NMDA MK-801 blokował CSD i hamował aktywność MMP-9. (A) Miejscowe MK-801 podawano 15 minut przed CSD. Nie wykryto zmiany w ekspresji MMP-2. Wyniki te sugerują, że aktywność MMP-9 jest związana z CSD, ale nie z igłą (n = 3). (B) Nieselektywny inhibitor metaloproteazy GM6001 podawano dootrzewnowo i 4 godziny po CSD (65 mg / kg na każdą). Znaczące obniżenie aktywności MMP-9 stwierdzono metodą zymografii żelu 12 godzin później (dwie z trzech próbek wykazały obniżony lub brak poziomu MMP). Wyniki te wskazują, że CSD zwiększa aktywność MMP in vivo. Następnie zbadaliśmy, czy podawanie inhibitora MMP powoduje ogólnoustrojową redukcję aktywności rozszczepiania żelatyny wywołanej CSD. Zaobserwowaliśmy wyraźne obniżenie poziomu MMP-9 w homogenatach korowych (ryc. 3B, n = 3). Dane te są zgodne z poprzednim raportem pokazującym, że aktywność zymograficzna MMP zmniejsza się po podaniu nieselektywnego inhibitora MMP in vivo (25). Wzmacniają one obserwację, że CSD zwiększa aktywność MMP i że dowody uzyskane za pomocą zymografii żelatynowej były specyficzne dla MMP. Aby określić przestrzenne położenie aktywności MMP-9 po CSD, zbadano cięcie fluorogennego substratu żelatyny DQ w skrawkach tkanek (Figura 4, A i B) [patrz też: grudziądz jednostka wojskowa, pijalnia wódki i piwa kraków, sos brokułowy do makaronu ] [przypisy: motochemia, deccoria galerie, genji sushi ]