Rozszerzająca się depresja korowa aktywuje i podwyższa MMP-9 ad 8

Drugie przeciwciało znakowane Cy3 zastosowano do znakowania ZO-1, a znakowany FITC zastosowano do znakowania RECA. Podwójnie oznakowane sekcje (trzy na każde zwierzę) przechodzące przez hipokamp analizowano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Zeiss LSM-Pascal. Kora każdej sekcji została podzielona na dziesięć interesujących regionów zarówno po stronie CSD, jak i poza CSD, a współczynnik kolokalizacji został obliczony dla obszaru. Uzyskano średnią z trzech sekcji na zwierzę; wartości są wyrażone jako średnia + SEM. Analiza Western blot. Tkanki homogenizowano w buforze do radioimmunoprecypitacji (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% SDS i 0,5% kwasu dezoksycholowego), PMSF (0,1 mM) i inhibitora proteinazy. koktajl (Sigma-Aldrich). Po pomiarze białka i elektroforezie w żelu poliakryloamidowym białka przeniesiono na membrany PVDF i inkubowano z przeciwciałem lamininowym (rozcieńczenie 1: 500, Sigma-Aldrich). Po przemyciu roztworem soli buforowanym Tris z 0,1% Tween-20 (Sigma-Aldrich), membrany inkubowano w drugorzędowym przeciwciele znakowanym peroksydazą chrzanową przez godzinę. Następnie białka wizualizowano za pomocą ulepszonej procedury chemiluminescencyjnej (Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey, USA). P-Atynę stosowano jako wzorzec wewnętrzny. Densytometrię przeprowadzono przy użyciu oprogramowania MCID Elite. RT-PCR. Całkowity RNA wyizolowano z tkanki mózgowej CSD i nie-CSD, stosując Trizol i odwrotną transkrypcję z użyciem SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Zastosowano system syntezy pierwszej nici (Invitrogen) zgodnie z zaleceniami producenta. Zastosowano następujące startery: szczurzy MMP-9, 5 (3 -AGATGTGGGTGTACACAGGC-3. i 5a-TTCACCCGGTTGTGGAAACT-3 .; szczurzy GAPDH, 5. -TTAAGGGCATCCTGAGCTACACT-3. i 5a-TTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-3 .. Badania farmakologiczne. Inhibitor metaloproteazy o szerokim spektrum działania GM6001 (65 mg / kg dootrzewnowo, Chemicon) podawano godzinę przed i 4 godziny po indukcji CSD. GM6001 podawano dootrzewnowo w postaci zawiesiny 7 mg / ml w 45% cyklodekstrynie (waga / objętość), jak opisano (26). Kontrole otrzymały taką samą objętość nośnika (45% cyklodekstryny [masa / objętość]) na godzinę przed i 4 godziny po trzech CSD. Aby zapewnić, że MMP są aktywowane CSD, a nie igłą lub urazowym urazem, bloker receptora NMDA MK-801 (Sigma-Aldrich) zastosowano miejscowo (5 mM, 100 ul) na 15 minut przed igłą. MK-801 blokuje propagację fal CSD, ale nie blokuje bezpośrednio aktywacji enzymatycznej MMP (nasze niepublikowane dane). Wycieki albumin i pomiary obrzęku mózgu. Do kwantyfikacji znacznika po CSD wstrzyknięto 2% błękit Evansa (dawka 3 ml / kg za pośrednictwem żyły ogonowej 15 minut przed indukcją CSD). Szczury perfundowano zimną solą fizjologiczną, a tkanki z pirolitycznych lub innych homologicznych kory ważono i homogenizowano w dziesięciokrotnej objętości 50% kwasu trichlorooctowego. Po odwirowaniu supernatanty rozcieńczono czterokrotnie etanolem. Intensywność fluorescencji mierzono za pomocą mikropłytkowego czytnika fluorescencji (wzbudzenie 620 nm, emisja 680 nm, Wallac, Perkin Elmer, Wellesley, Massachusetts, USA). Obliczenia oparto na zewnętrznych wzorcowych odczytach, a wynaczyniony barwnik wyrażono jako nanogramy na miligram tkanki lub jako wyciek po stronie CSD / nie-CSD. Obrzęk wyrażono jako suchą masę / mokrą masę tkanki mózgowej CSD. Po CSD mózgi usunięto i zważono, a następnie suszono w temperaturze 99 ° C przez 48 godzin i ponownie ważono. Analiza statystyczna. Wszystkie dane są przedstawione jako średnie. Wartości SEM. Różnice między grupami określano za pomocą testu ucznia lub dwuczynnikowej ANOVA dla powtarzanych pomiarów lub jednoczynnikowej ANOVA, a następnie korekcji Bonferroniego. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. PodziękowaniaTa praca została sfinansowana ze sponsorowanego przez NIH projektu programu Stroke Program (NS10828). Y. Gursoy-Ozdemir był częściowo wspierany przez stypendium International Brain Research Organisation oraz stypendium Fulbrighta. G. Rosenberg był wspierany przez NIH R01 NS21169-11 i przyznanie Amerykańskiego Towarzystwa Kardiologicznego (American Heart Association Grant-in-Aid). Dziękujemy Christian Waeber i Munire Kilinc za ich wsparcie i doskonałą pomoc techniczną. Chcemy podziękować Robertowi Seniorowi (Washington University, St Louis) za użycie myszy z nokautem MMP-9. Przypisy Yasemin Gursoy-Ozdemir i Jianhua Qiu w równym stopniu przyczyniły się do tej pracy. Zastosowano niestandardowe skróty: bariera krew-mózg (BBB); depresja depresji korowej (CSD); antygen bariery śródbłonka (EBA); białko kwaśne włókniste glejowe (GFAP); antygen komórek szczurzych komórek śródbłonka (RECA); tkankowy aktywator plazminogenu (tPA); zonula occludens-1 (ZO-1). Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
[więcej w: leki na nadczynność tarczycy, fishing24, motochemia ]
[hasła pokrewne: bałkanica kraków, no game kraków, u romana kraków ]