Rozszerzająca się depresja korowa aktywuje i podwyższa MMP-9 ad 7

Próbki tkanek homogenizowano (a immunoprecypitaty ponownie zawieszano) w buforze roboczym. (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 5 mM CaCI2, 0,05% BRIJ-35 i 0,02% NaN3). Białka (25 ug) rozdzielono przez elektroforezę za pomocą 10% żelów zymogramowych z poliakryloamidu zawierających żelatynę (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) w warunkach niedenaturujących i nieredukujących. Po przemyciu 2,5% Triton X-100 w celu usunięcia SDS, a następnie w 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, żele inkubowano przez noc w buforze rozwijającym (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl2, Catharines, Ontario, Kanada). Zymografia in situ i podwójne znakowanie przy użyciu sond fluorescencyjnych. In situ aktywność żelatynolityczną przeprowadzono na zamrożonych skrawkach mózgu o grubości 10 urn przy użyciu komercyjnego zestawu (EnzCheck Gelatinase Assay Kit, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA). Skrawki inkubowano z koniugatem żelatynowym DQ, substratem fluorogennym, w 37 ° C przez noc, a następnie, po umyciu, utrwalono w 4% paraformaldehydzie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Odszczepienie żelatyny DQ przez MMP dało zielony produkt fluorescencyjny (długości fali: wzbudzenie, 495 nm, emisja, 515 nm). Porównywano homologiczne regiony mózgu. Niektóre wycinki tkanek inkubowano z chelatującym cynkiem 1,10-fenantroliną (1 mM w DMSO, Molecular Probes), niespecyficznym inhibitorem aktywności MMP. Po ocenie aktywności żelatynowej in situ, niektóre utrwalone skrawki tkanek inkubowano z przeciwciałami skoniugowanymi z Cy3 specyficznymi dla neuronów (NeuN; rozcieńczenie 1: 200; Chemicon, Temecula, California, USA), astrocyty (GFAP; rozcieńczenie 1: 200; Sigma- Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), śródbłonek (RECA, rozcieńczenie 1: 200, Serotec, Raleigh, Karolina Północna, USA) i mięsień gładki naczyń (SMA, rozcieńczenie 1: 200, Sigma-Aldrich). Sekcje osadzone przy użyciu zestawu anty-fade (SlowFade; Molecular Probes) badano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Zeiss LSM-Pascal (Oberkochen, Niemcy) i / lub mikroskopu fluorescencyjnego. Wykonano obrazowanie pojedynczych odcinków optycznych (o grubości 1,8 ą 5,1 um). Kwantyfikacja naczyń pozytywnych dla zymografii in situ. Skrawki otrzymano 15-30 minut po jednym CSD. Pozytywnie znakowane naczynia zarówno na stronie CSD, jak i nie-CSD zliczano ręcznie na całej blaszce korowej (powiększenie, około 200) w czterech kolejnych odcinkach uzyskanych około 4 mm za tylnym biegunem i przechodzących przez hipokamp. Osoby testujące nie były świadome protokołu eksperymentalnego stosowanego dla każdej próbki. Immunohistochemia. Po przedawkowaniu pentobarbitalu zwierzęta perfundowano dosercowo heparynizowanym roztworem soli (50 ml dla szczura i 20 ml dla myszy), a następnie 4% paraformaldehydem w PBS. Mózgi utrwalano przez 24 godziny z tym samym utrwalaczem, a następnie zamrożono kriogenicznie w 30% sacharozie i podzielono na 40 .m. W przypadku barwienia immunohistochemicznego skrawki przemywano w PBS i inkubowano w 10% surowicy osła w PBS zawierającym 0,35% Triton X-100 przez 30 minut. Następnie inkubowano je z pierwszorzędowymi przeciwciałami w 2% surowicy osła przez noc w 4 ° C. Przeciwciała przeciwko EBA (rozcieńczenie 1: 200, Stenberger Monoclonals Inc., Lutherville, Maryland, USA), laminina (rozcieńczenie 1: 500, Sigma-Aldrich) i ZO-1 (rozcieńczenie 1: 100, Zymed, South San Francisco, Kalifornia , USA). Pierwotne pominięcie przeciwciał, inkubacje z roztworem blokującym lub PBS i porównanie z analizą Western blot przeprowadzono w celu zbadania specyficzności obserwowanej immunoreaktywności. Po przemyciu sekcje inkubowano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny w 2% surowicy osła z drugorzędowymi przeciwciałami znakowanymi FITC (rozcieńczenie 1: 200). Skrawki następnie przemyto i zamontowano przy użyciu zestawu anty-fade (SlowFade; Molecular Probes) i zbadano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Zeiss LSM-Pascal i / lub mikroskopu fluorescencyjnego. Pojedyncze sekcje optyczne (o grubości 1,8 .m, 5,1 .m) zebrano i otrzymano pseudokolorowe. zgodnie z ich oryginalnymi fluorochromami. Naczynia krwionośne (pełna grubość) zostały zobrazowane. Naczynia krwionośne (pełna grubość) zostały zbadane za pomocą obrazowania z użyciem Z (LSM Pascal, Zeiss, Oberkochen, Niemcy). Kwantyfikacja ZO-1 i RECA. Barwienie immunologiczne ZO-1 przeprowadzono jak opisano w Methods. Skrawki otrzymano 12 godzin po trzech CSD. Po przemyciu w PBS, skrawki inkubowano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej w 2% surowicy osła z RECA (rozcieńczenie 1: 200; Serotec)
[hasła pokrewne: węglowodany złożone tabela, pijalnia wódki i piwa kraków, nadczynność tarczycy leki ]
[patrz też: deli 8, well done kraków, motochemia kraków ]