Rola heterologicznych połączeń między czerniakiem a komórkami śródbłonka w przerzutach czesc 4

W przypadku negatywnych kontroli, dobrane izotypowo immunoglobuliny, mysie IgG1 (MOPC-21, Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, USA); chomicze IgG, grupa 3 (A19-4, PharMingen) i szczurze IgG2a (R35-95, PharMingen), zastosowano w stężeniu jako swoiste przeciwciała. Skrawki przemywano PBS i barwiono wtórnymi przeciwciałami sprzężonymi z FITC w rozcieńczeniu 1: 1000 stosując anty-mysie IgG (MBL, Nagoya, Japonia) dla Cx26, Cx43, VE-kadheryny i paxillin; IgG przeciw chomiczce (koktajl; Pharmingen) dla integryny av; i anty-szczurze IgG (MBL) dla PECAM-1. Skrawki obserwowano za pomocą mikroskopu Axioplan2 (Carl Zeiss) wyposażonego w epifluorescencję. Sąsiadujące skrawki wybarwiono hematoksyliną i eozyną (H & E). Test spontanicznego przerzutu. Komórki (2 x 105) wstrzyknięto podskórnie w podeszwę 4-tygodniowej, męskiej myszy C57BL / 6 (cztery myszy na klon). Wielkość guza monitorowano przez bezpośredni pomiar średnic co 2 lub 3 dni. Trzy tygodnie później, gdy guzy osiągnęły średnicę 8-10 mm, amputowano nogi z guzem wraz z prawym podkolanowym węzłem chłonnym. Myszom pozwolono przetrwać kolejne 4 tygodnie; następnie wykonano autopsje i zliczono przerzutowe kolonie utworzone w obustronnych płucach. Niezależne eksperymenty powtórzono trzy razy. Ludzkie próbki melanocytowe. Próbki czerniaka uzyskano od 12 pacjentów z czerniakiem skóry. Pacjentów poddano operacji w momencie rozpoznania, a ich postępy obserwowano przez ponad 5 lat w Szpitalu Uniwersyteckim w Osace. Pięć zmian skórnych z nacięciem śródskórnym wycinano od poszczególnych pacjentów w tym samym szpitalu. Próbki chirurgiczne utrwalono w 4% paraformaldehydzie i zatopiono w parafinie. Skrawki zostały wykorzystane do diagnostyki i immunohistochemii. Zmiany czerniaka zostały zdiagnozowane na podstawie poziomu Clarka (31). Wyniki zależne od Cx26 sprzężenie barwników między czerniakiem a komórkami śródbłonka. Podczas badania różnic w poziomach ekspresji genów między komórkami F10 i BL6 metodą odejmowania cDNA, stwierdziliśmy, że ekspresja genu Cx26 była pięciokrotnie podwyższona w komórkach BL6 (rysunek 1a). Konsekwentnie komórki BL6 wykazywały znacznie wyższy poziom białka Cx26 w porównaniu z komórkami F10 (Figura 1b). W B16, który jest rodzicielskim szczepem obu komórek F10 i BL6, poziom ekspresji genu Cx26 i białka był podobny do poziomu komórek F10 (dane nie pokazane). Poziomy mRNA dla innych koneksyn były poniżej granicy wykrywalności zarówno w komórkach F10, jak i BL6 (Figura 1a). Pięć klonów niosących pełnej długości cDNA Cx26 izolowano z biblioteki cDNA BL6 i sekwencjonowano. Nie wykryto mutacji w ich regionach kodujących. Przeprowadziliśmy test przeniesienia barwnika w celu zbadania, czy zdolność GJIC wzrosła w komórkach BL6. W warunkach hodowli in vitro, komórki F10 i BL6 nie wykazywały żadnej zdolności GJIC (dane nie pokazane). Zbadaliśmy także przenikanie barwnika od czerniaka do komórek jednowarstwowych fibroblastów NIH3T3 i od komórek czerniaka do komórek monowarstwy SVEC4-10 lub HUV-EC-C w warunkach hodowli in vitro. Tutaj również wykryto małe lub żadne sprzężenie barwników (dane nie pokazane). Figura Ekspresja różnych koneksyn w komórkach F10 i BL6 oraz w segmencie IVC. (a) Analiza typu Northern w celu wykrycia transkryptów Cx26, Cx32, Cx43, Cx37 i Cx40. Jako kontrolę pozytywną użyto wątroby myszy, tkanek serca i płuc oraz komórek SVEC4-10. (b) Ekspresja białka Cx26 w komórkach F10 i BL6. Lizaty komórkowe ekstrahowano przez traktowanie alkaliczne. Przeciwciało anty-Cx26 wykryło monomeryczne białko Cx26 przy około 24 kDa (wskazane strzałką w prawym panelu). Równe obciążenie białkiem potwierdzono przez barwienie srebrem żelu (lewy panel). Dlatego opracowaliśmy kokulturę, w której umieściliśmy otwarty segment żyły, z jego powierzchnią luminalną na górze, na dnie naczynia hodowlanego i na nim zaszczepiono komórki czerniaka. Zbadaliśmy, czy otwarte segmenty IVC zachowały integralność monowarstwy komórek śródbłonka podczas uprawy. Na początku hodowli jedynie powierzchnie światła segmentów IVC umiejscowione blisko krawędzi cięcia barwiono błękitem trypanu, ale obszary centralne (powyżej 80% całkowitej powierzchni) nie były (dane nie pokazane). Tak było w przypadku segmentów IVC po 2. 6 godzinach uprawy (dane nie pokazane). Aby dodatkowo zidentyfikować komórki śródbłonka, poprzeczne skrawki segmentów IVC poddano reakcji z przeciwciałami przeciw PECAM-1 i integryną av, dwóch białek specyficznie eksprymowanych na błonach komórek śródbłonka. Oba przeciwciała zabarwiły powierzchnię światła w segmencie IVC (ryc. 2, aib). Ponadto, reaktywność przeciwciała antyintegrynowego v v narysowała linię, która była równoległa do powierzchni światła, odpowiadającą śródbłonkowej błony podstawnej (Figura 2b).
[hasła pokrewne: pompon komis, skierowanie do szpitala psychiatrycznego, pijalnia wódki i piwa kraków ]
[przypisy: deccoria galerie, genji sushi, królestwo pierożka ]