Rola heterologicznych połączeń między czerniakiem a komórkami śródbłonka w przerzutach cd

Sondę Cx26 przygotowano z fragmentu cDNA AscI-ApaI obejmującego otwartą ramkę odczytu. Sondy Cx32 (nukleotydy [nt] 50-582) (26), Cx37 (nt 73-940) (27), Cx40 (nt 154-826) (28) i Cx43 (nt 458-1075) (wejście do GenBank numer X61576) uzyskano stosując PCR. Sondę (3-aktyny przygotowano w taki sam sposób (3). Bloty przemywano do ostatecznej ostrości 0,1 x SSC i 0,1% SDS w 50 ° C przed ekspozycją. Względną intensywność sygnału obliczono za pomocą systemu BAS 2000 (Fuji Photo Film Co., Tokio, Japonia). Analiza Western blot. Lizaty komórkowe wytworzono przez traktowanie zasadowe w celu wzbogacenia integralnych białek błonowych zgodnie z procedurą opisaną (29). Jeden mikrogram komórek lizatu komórkowego oddzielono 10% SDS-PAGE i przeniesiono na błonę Immobilon (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). Membranę inkubowano z mysim mAb anty-Cx26 (rozcieńczenie 1: 300) (CX-12H10; Zymed, San Francisco, Kalifornia, USA) przez 2 godziny, a następnie inkubowano z skoniugowanym z peroksydazą chrzanową anty-mysim przeciwciałem IgG (1: 1000). rozcieńczenie: Cappel Research Products, Durham, North Carolina, USA). Po przemyciu PBS, blot poddano reakcji z reagentami chemiluminescencyjnymi Renaissance (NEN Life Science Products Inc., Boston, Massachusetts, USA) przed ekspozycją. Duplikat żelu barwiono srebrem zgodnie z instrukcjami producenta (Daiichi Pure Chemicals Co., Tokio, Japonia). Przygotowanie i hodowla segmentów żył. Preparat tkankowy wykonano zasadniczo zgodnie z procedurą opisaną (30). Segmenty żyły (mierzące w przybliżeniu 8 mm) wycięto ostrożnie z klatki piersiowej części żyły dolnej dolnej (IVC) świeżo uśmierconych myszy i natychmiast przeniesiono do pożywki wzrostowej. Następnie cienką sondę wprowadzono do światła żyły, a wzdłużne cięcie wykonano za pomocą ostrza skalpela na ścianie żyły wraz ze sondą. Segment żyły, z jego powierzchnią luminalną na górze, został starannie rozciągnięty i przypięty do arkusza z gumy silikonowej za pomocą szpilek minutowych (Watkins & Doncaster, Kent, Wielka Brytania). Po sklejeniu segmentu arkusz gumy z żyłą umieszczono na dnie 35-mm naczynia hodowlanego wypełnionego pożywką wzrostową. Obszar otwartej żyły miał kwadrat około 7 mm × 7 mm. Po powyższym przygotowaniu przeprowadzono test przeniesienia barwnika stosując hodowlę żył. Niektóre odcinki żyły zastosowano do wizualnego monitorowania integralności śródbłonka. Po 0, 2, 4 i 6 godzinach po rozpoczęciu hodowli, segmenty żyły inkubowano przez 1-2 minut w temperaturze pokojowej w PBS zawierającym 0,01% błękit trypanowy (Flow Laboratories, Irvine, Szkocja) i obserwowano przez stereomikroskop. (SZH-ILLD; Olympus Optical Co., Osaka, Japonia). Test przeniesienia barwnika. Do znakowania komórek czerniaka dodano ester acetonimetylowy kwasu 2. 7a-bis (karboksyetylo) -5 (i-6) karboksyfluoresceiny (BCECF) (Dojindo, Kumamoto, Japonia) do hodowli w fazie logarytmicznej przy końcowym stężeniu 1. M . Trzy godziny później zmieniono podłoże i kontynuowano hodowlę przez godzinę. Komórki zebrano i przemyto trzy razy PBS. Prawie wszystkie komórki wykazywały jednakową intensywność fluorescencji. Tworzenie in vitro GJIC między komórkami czerniaka, pomiędzy czerniakiem i komórkami NIH3T3, pomiędzy czerniakiem i komórkami SVEC4-10, oraz pomiędzy czerniakiem i komórkami HUV-EC-C oszacowano stosując hodowlę hodowli monowarstwowej, jak opisano (15). Aby przygotować hodowlę komórek czerniaka i segmentu żył, komórki znakowane BCECF (106) wysiewano na odcinek żyły, który został umieszczony na dnie naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm. W różnych punktach czasowych hodowaną tkankę utrwalano za pomocą 3% aldehydu glutarowego w buforze fosforanowym (0,1 M, pH 7,2) i obserwowano bezpośrednio przez mikroskop Axioplan2 (Carl Zeiss, OberKochen, Niemcy) wyposażony w epifluorescencję. Intensywność fluorescencji została przekształcona na 256-kolorowe widmo za pomocą oprogramowania Adobe Photoshop (wersja 3.5, Adobe Systems Inc., Mountain View, Kalifornia, USA) na komputerze Macintosh. Liczbę komórek wykazujących sprzężenie barwników z komórkami śródbłonka obliczono, obserwując 500 komórek na szalkę i łącząc dane z trzech eksperymentów. Immunohistochemia. Segmenty żyły w różnych okresach hodowli i tkanek ludzkiego czerniaka utrwalano 4% paraformaldehydem, zatapiano w parafinie i przecinano seryjnie. Skrawki inkubowano z przeciwciałami przeciwko Cx26 (CX-12H10, Zymed), Cx43 (klon 2, Transduction Laboratories, Lexington, Kentucky, USA), VE-kadheryna (kadheryna-5, klon 75, Transduction Laboratories), paxillin (klon 349; Transduction Laboratories), integryna av (H9.2B8, PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA) i PECAM-1 (MEC13.3, PharMingen) w rozcieńczeniu 1: 100 przez noc w 4 ° C
[więcej w: trufla kraków, globulki dopochwowe przeciwzapalne, pompon komis ]
[patrz też: u romana kraków, papryczki 5, motochemia ]