Rola heterologicznych połączeń między czerniakiem a komórkami śródbłonka w przerzutach ad

Ludzkie komórki śródbłonka HUV-EC-C zakupiono od ATCC i utrzymywano w pożywce do hodowli komórek HUVE (Nissui Pharmaceutical Co., Tokio, Japonia). W celu utrzymania transfektantów pożywkę wzrostową uzupełniono G-418 o końcowym stężeniu 2 mg / ml. Izolacja klonów cDNA. Całkowity RNA ekstrahowano metodą tiocyjanianu guanidyny / CsTFA z komórek F10 i BL6, a następnie poli (A) + RNA oczyszczono stosując celulozę oligo-dT. Biblioteki cDNA przygotowano metodą łącznik-starter z użyciem plazmidu pAP3neo, a bibliotekę cDNA odejmowaną zbudowano zgodnie ze sposobami opisanymi gdzie indziej (2. 4). Po czterokrotnym powtórzeniu procesu odejmowania około 1500 klonów zostało uratowanych. Na podstawie tego, klony transkrypcyjnie upregulated w komórkach BL6 zostały wybrane przez analizę Northern blot i zsekwencjonowane. Sekwencje DNA wykorzystano do przeszukiwania bazy danych o wysokiej przepustowości sekwencji genomowych (htgs) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_databases.html) za pomocą algorytmu Basic Alignment Search Tool (BLASTN). Kolonie (2 x 106) biblioteki cDNA BL6 w pAP3neo przeniesiono na membranę nylonową i hybrydyzowano z insercjami klonów cDNA znakowanych [a-32P] dCTP z odjętej biblioteki cDNA. Plazmidowe DNA oczyszczono z dodatnich kolonii i zsekwencjonowano. Konstrukcja plazmidowa. Używając wektora pAP3neo zawierającego cDNA pełnej długości dla Cx26 (pAP3neo-Cx26) jako matrycy, przeprowadzono PCR z następującym zestawem starterów: F-Asc-ATG, 5a-CATGGCGCGCCGATGGATTGGGGCACACTCC-3. (zawierające stronę AscI na końcu 5.); R-Cx26, 5a-TTTGTTTGGGAGCTTTGGGG-3 .. Zamplifikowane przez PCR fragmenty DNA, odpowiadające 5. część cDNA Cx26 potraktowano polimerazą DNA Klenowa, a następnie BstXI. Konstrukt plazmidu pAP3neo-Cx26 traktowano sekwencyjnie MluI, polimerazą DNA Klenowa i BstXI w celu otrzymania linearyzowanego konstruktu plazmidowego pozbawionego 5. część cDNA Cx26. Uzyskany plazmid zligowano ze zamplifikowanymi za pomocą PCR fragmentami DNA traktowanymi tak, aby zawierały tępe 5. końce i strony BstXI na 3. kończy się. Długi 1,3-kb w ramce AscI-ApaI (miejsce ApaI znajduje się w fragmencie cDNA o długości 3 uTR z Cx26) dla Cx26 zastosowano jako wstawkę do ligacji z wektorem ekspresyjnym pcDNA3, który zawiera promotor cytomegalowirusa ( Invitrogen, San Diego, Kalifornia, USA), po modyfikacji pcDNA3 w następujący sposób (pcDNA3-Cx26WT). Syntetyczny łącznik niosący miejsce AscI (5a-GCTTGGCGCGCCA-3a) wstawiono do miejsca Hindlll wektora pcDNA3. Ta modyfikacja umożliwiła fuzję insertu cDNA w ramce za pomocą miejsc AscI-ApaI. Trzy substytucje Cys-60. Phe, Pro-87. Leu i Arg-143. Trp wprowadzono do cDNA typu dzikiego Cx26, stosując opisaną tu metodę mutagenezy, jak opisano (pcDNA3-Cx26C60F, pcDNA3-Cx26P87L i pcDNA3-Cx26R143W) (25). Aby otrzymać cDNA pełnej długości myszy dla Cx32, przeprowadzono PCR z użyciem cDNA mysiej wątroby jako matrycy z następującym zestawem starterów: F-Cx32, 5a-CATGGCGCGCCGATGAACTGGACAG-3. (zawierające stronę AscI na końcu 5.); R-Cx32, 5a-TAGGAAGGGAGGGAAGGTTTGA-3 .. Zamplifikowany przez PCR fragment cDNA subklonowano do wektora T7Blue (Novagen, Madison, Wisconsin, USA). Po amplifikacji, długi na 1,0 kb, w ramce AscI-Notl (miejsce Notl znajduje się w miejscu wielokonkolenia wektora T7Blue) fragment cDNA dla Cx32 wycięto i ligowano ze zmodyfikowanym wektorem pcDNA3 za pomocą AscI-Notl. strony (pcDNA3-Cx32WT). Wszystkie konstrukty plazmidów sekwencjonowano w celu potwierdzenia, że żadna mutacja nie została wprowadzona przez PCR. Klony transfektantów. Komórki F10 i BL6 transfekowano wektorem pcDNA3 zawierającym formy dzikiego typu lub zmutowane Cx26 lub Cx32 przy użyciu techniki koprecypitacji fosforanu wapnia i wybrano pod kątem oporności na G-418 (2 mg / ml). Klonami F10 były: F10-pcDNA3 zawierający puste pcDNA3; trzy niezależne klony, F10-Cx26WT-1, -2 i -3 zawierające pcDNA3-Cx26WT; F10-Cx26C60F, F10-Cx26P87L i F10-Cx26R143W zawierające odpowiednio pcDNA3-Cx26C60F, pcDNA3Cx26P87L i pcDNA3-Cx26R143W; dwa niezależne klony, F10-Cx32WT-1 i -2 zawierające pcDNA3-Cx32WT. Klony BL6 to: BL6-pcDNA3 zawierający puste pcDNA3; dwa niezależne klony, BL6-Cx26C60F-1 i -2 zawierające pcDNA3-Cx26C60F; i trzy niezależne klony, BL6-Cx26R143W-1, -2 i -3 zawierające pcDNA3-Cx26R143W. Analiza Northern blot. Pięć mikrogramów całkowitego RNA wyekstrahowanego z hodowanych komórek, mysich tkanek lub in vivo rosnących guzów frakcjonowano na 1% żelu agarozo-formaldehydowym, przeniesiono na membranę nylonową i hybrydyzowano z sondami DNA znakowanymi [. -32P] dCTP przez losowe metoda znakowania heksamerami
[podobne: leki na nadczynność tarczycy, moja historia odchudzania, skierowanie do szpitala psychiatrycznego ]
[patrz też: motochemia kraków, bałkanica kraków, no game kraków ]