Rola heterologicznych połączeń między czerniakiem a komórkami śródbłonka w przerzutach ad 6

W każdym z nich analizowaliśmy 500 komórek BCFF znakowanych BCECF zaszczepionych na segmencie IVC. Przy 4 godzinach kokultury średnio 22 komórki BL6 wykazywały sprzężenie barwników z komórkami śródbłonka (Figura 3g). Gdy obserwowaliśmy wspólnie hodowane tkanki w innych odstępach czasowych, liczba komórek BL6 wykazujących sprzęganie barwnika z komórkami śródbłonka była podobna do tej po 4 godzinach (danych nie pokazano). W przeciwieństwie do tego, małe lub zerowe sprzężenie barwników obserwowano w dowolnych współ-hodowlach zawierających F10. Różne klony F10 i BL6 otrzymano przez transfekcję dzikim i zmutowanymi formami Cx26 i Cx32 (Figura 4b, blot). Mutacje C60F, P87L i R143W Cx26 zlokalizowane są odpowiednio w pierwszej zewnątrzkomórkowej oraz drugiej i trzeciej domenach transbłonowych i wywierają różne dominujące negatywne efekty na Cx26 (25). Pierwszy z nich unieważnia GJIC z udziałem Cx26, a dwa ostatnie unieważniają kontrolę wzrostu komórek za pośrednictwem Cx26 w komórkach HeLa (25). Klony transfektantowe badano pod kątem zdolności GJIC komórkami śródbłonka zgodnie z powyższym protokołem. Figura 3g pokazała wyniki 4-godzinnej hodowli; wyniki w pozostałych czterech przedziałach były zasadniczo podobne. Komórki F10-Cx26WT-1, -2 i -3 wykazywały sprzęganie barwnika tak często, jak komórki BL6. Transfekcja mutantem C60F lub R143W nie podniosła zdolności do łączenia barwników komórek F10, podczas gdy transfekcja zmutowaną postacią P87L dała kilka kompetentnych komórek F10 sprzęgających barwnik. Tak więc, dwie poprzednie zmutowane postacie wprowadzono do komórek BL6 w celu zbadania, czy te zmutowane formy znoszą zdolność sprzęgania barwnika komórek BL6. Wśród komórek dwóch klonów BL6-Cx26C60F i trzech klonów BL6-Cx26R143W tylko nieliczne wykazywały sprzężenie barwników, co wskazuje na dominujący negatywny wpływ mutacji C60F i R143W w tym teście. Komórki F10-Cx32WT-1 i -2 wykazywały niedobór sprzężenia barwników. Figura 4 Test przerzutów samorzutnych transfektantów Cx26 i Cx32. (a) Pierwotny wzrost nowotworu w miejscu inokulacji (prawy podbródek). Krzywe wzrostu dla pięciu reprezentatywnych klonów wyrażono jako średnią i SE trzech niezależnych doświadczeń. Wartości innych użytych klonów mieściły się w zakresie tych pięciu klonów w dowolnym punkcie czasowym. Nie było znaczącej różnicy między klonami. (b) Liczba kolonii w płucach wytwarzanych przez różne klony F10 i BL6. Klony F10-pcDNA3 i BL6-pcDNA3 są kontrolami wektorowymi. Dane wyrażono jako średnią i SE trzech niezależnych eksperymentów. AP <0,05 w teście w porównaniu z wartością uzyskaną z komórek F10. BP <0,05 na t test w porównaniu z wartością uzyskaną z komórek BL6. Northern blot pokazuje wykrywanie endogennego i egzogennego mRNA Cx26 i Cx32 w każdym klonie. (c) Reprezentatywne wyniki płucnych kolonii przerzutowych wytwarzanych przez komórki F10, BL6, F10-Cx26WT-1 i BL6-Cx26C60F-1. Należy zauważyć, że komórki BL6 i BL6-Cx26C60F-1 wytwarzały kolonie w postaci stałej czerni, podczas gdy komórki F10-Cx26WT-1 wytwarzały kolonie amelanotyczne, jak również melanotyczne. Metastatyczny fenotyp transfektantów Cx. Przeanalizowaliśmy przerzutową biegłość kompetycyjnych komórek barwnikowych - kompetentnych klonów F10 i komórek BL6 z niedoborem sprzężonym z barwnikiem. Oryginalne komórki czerniaka i ich transfektanty wstrzyknięto podskórnie do łapek myszy. Wzrost guza w miejscu wstrzyknięcia był taki sam dla wszystkich badanych klonów (Figura 4a). Klony F10 transfekowane Cx26 typu dzikiego były bardziej przerzutowe niż nietransfekowane komórki F10, a transfekcja zmutowanymi formami Cx26 nie zmieniała przerzutowego fenotypu komórek F10 (Figura 4b). Niektóre kolonie płuc wytwarzane przez klony F10-Cx26WT wyglądały na amelanotyczne, co kontrastowało z trwałym czarnym wyglądem kolonii pochodzących od BL6 (Figura 4c). Mutacje C60F i R143W wywoływały efekt hamujący spontaniczne przerzuty komórek BL6. Spośród pięciu klonów BL6 z niedoborem sprzęgania barwnika BL6, komórki BL6-Cx26C60F-1, BL6-Cx26R143W-1 i -3 wykazywały trzykrotnie mniej przerzutowe kolonie w porównaniu z oryginalnymi komórkami BL6 (Figura 4, b i c). Z drugiej strony zmniejszenie liczby kolonii przerzutowych przez inne klony BL6 było niewielkie. Istniała możliwość, że poziomy ekspresji in vivo Cx26 różniły się od poziomów in vitro. Zbadaliśmy ekspresję genu Cx26 w nowotworach różnych klonów rosnących w łapach i płucach i stwierdziliśmy, że poziom ekspresji endogennego i egzogennego genu Cx26 w każdym klonie był zasadniczo taki sam jak w hodowanych komórkach (dane nie pokazane). Ekspresja Cx26 w ludzkim czerniaku. Kliniczne znaczenie Cx26 dla złośliwych fenotypów ludzkich zmian melanocytowych oceniano za pomocą immunohistochemii. Zbadaliśmy pięć przypadków śródskórnego znamię, pięć przypadków czerniaka in situ (poziom I Clarka) i siedem przypadków z bardziej zaawansowanym czerniakiem (poziom III lub IV Clarka) [hasła pokrewne: spaghetteria kobierzyńska, skierowanie do szpitala psychiatrycznego, biustonosz sportowy nike ] [hasła pokrewne: nova krova, pod norenami, spaghetteria kobierzyńska ]