Polimorfizm miejsca wiązania Sp1 COL1A1 predysponuje do złamania osteoporotycznego przez wpływ na gęstość i jakość kości cd

Przeprowadzono rozległe eksperymenty w celu walidacji testu, w tym eksperymenty wzbogacania, w których próbki docelowego DNA odpowiadające każdemu allelowi mieszano w znanych ilościach i oceniano obfitość produktu oraz zmieniono liczbę cykli w drugiej rundzie PCR, aby zapewnić obfitość produktu w obrębie faza liniowa amplifikacji PCR w wybranych warunkach. Doświadczenia te wykazały, że stosunek produktów specyficznych dla allelu dokładnie odzwierciedlał względną obfitość cząsteczek docelowych w wybranych warunkach (dane nie pokazane). Figura 3 Wpływ polimorfizmu COL1A1 na transkrypcję swoistą dla allelu u heterozygot. (a) Pozycja starterów zaprojektowanych do wykrywania miejsca polimorficznego w pozycji 1240 w pierwszym intronie ludzkiego genu COL1A1 (numer dostępu sekwencji M20789). (b) Reprezentatywne elektroforogramy z analizy GeneScan testów RFLP-PCR od jednego pacjenta. Równoważne ilości genomowego DNA (gDNA; do góry), cDNA (środkowy) i RNA bez odwrotnej transkrypcji (dół) zastosowano jako matrycę PCR. Zwiększona obfitość. transkrypty pochodzące z allelu są odzwierciedlane przez większy obszar pod krzywą produktów PCR po PCR p na analizę RFLP-PCR cDNA. (c) Oznacza. Stosunek SEM do obfitości produktu uzyskany z. S. i. S. allele gDNA. Wskaźniki mierzono w dwóch próbkach gDNA i cDNA od dziesięciu pacjentów. Produkcja białka kolagenu. Wytwarzanie białka kolagenowego oceniano przy użyciu pierwotnych hodowli ludzkich osteoblastów uzyskanych od pacjentów poddawanych operacji wymiany stawów, jak opisano wcześniej (22). Komórki hodowano do konfluencji i znakowano pulsowo przez 4 godziny 14C-proliną (Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.) (2 CiC / ml) w obecności 50 .g / ml kwasu askorbinowego. Po 24 godzinach kondycjonowaną pożywkę usunięto, dodano inhibitory proteazy (100 uM PMSF, 5 mM EGTA, 2 ug / ml leupeptyny) i białka wytrącono przez dodanie siarczanu amonu (176 mg / ml) z powolnym mieszaniem do 16 godzin w 4 ° C. Białka warstwy komórkowej ekstrahowano do 0,5 M kwasu octowego (pH 2,0). Białka pochodzące z warstwy komórkowej i kondycjonowanej pożywki połączono i trawiono pepsyną mg / ml przez noc w 4 ° C mieszając w celu degradacji nie-kolagenowych białek i usunięcia niehezyjnych części kolagenu. Reakcję zakończono przez zobojętnienie próbek do pH 7,0, a próbki następnie intensywnie dializowano wobec 0,1 M kwasu octowego przed liofilizacją. Próbki kolagenu z każdej hodowli rozdzielono na SDS-PAGE w trzech powtórzeniach z użyciem 4% żelu do układania w stos i 6% żelu rozdzielającego i a! (I) i a2 (I) łańcuchowo oznaczono przy użyciu systemu Packard Instant Phosphorimaging (Packard Instrument Co., Meriden, USA). Connecticut, USA). Test ochrony przed RNazą. Poziomy mRNA w stanie stacjonarnym oceniano za pomocą testu ochrony przed RNazą (RPA) przy użyciu zestawu RPA III (Ambion Inc., Austin, Texas, USA). Dla tych eksperymentów fragment o 267 bp ludzkich egzonów i 2 obejmujących cDNA COL1A1 obejmujący cDNA (numer dostępu sekwencji Z74615 stanowi 83a 350) i fragment 495-bp ludzkiego cDNA COL1A2 obejmujący egzony 25-32 (liczba sekwencji dostępu J03464 zasad 2001. 2496) wklonowano do wektorów pGEM T-easy (Promega Corp.). Jako kontrolę wewnętrzną wykorzystano fragment 170-pz ludzkiego eksonu 1-aktyny obejmującego cDNA obejmujący ekson (numer dostępu sekwencji X63432 zasady 545. 715) wklonowany do tego samego wektora. Antysensowne transkrypty znakowane [.-32P] UTP wytworzono z każdego klonu za pomocą polimerazy RNA SP6, stosując system transkrypcji Riboprobe in vitro (Promega Corp.). Próbki pacjentów (10 .g RNA) hybrydyzowano w pojedynczej probówce z sondami COL1A1, COL1A2 i P -actin. Chronione fragmenty rozdzielono na 5% denaturującym żelu poliakryloamidowym i oznaczono ilościowo za pomocą urządzenia Packard Instant Phosphorimager. Stosunek transkryptów COL1A1 / COL1A2 obliczono następnie po korygowaniu ekspresji p-aktyny. Kompozycja kostna i badania biomechaniczne. Cylindryczne rdzenie kości usunięto z górnych, tylnych, środkowych i centralnych miejsc w głowie kości udowej za pomocą pustego wiertła o średnicy 9 mm, jak opisano wcześniej (23). Miejsca te wybrano do reprezentowania regionów poddanych szeregowi warunków obciążenia in vivo (24). Chrząstkę stawową i podchrzęstną płytkę kostną usunięto z rdzeni kostnych, a oba końce przycięto równolegle. Powstałe rdzenie kości beleczkowatej o średniej wysokości 7,7. 1,6 mm poddano nieskrępowanemu testowi kompresji przy użyciu maszyny do testowania materiałów Instron 5564 (Instron, High Wycombe, Wielka Brytania). Test przeprowadzono przy szybkości odkształcania 20% na minutę (0,0033% / sekundę). Pozorną gęstość przemytych i odtłuszczonych próbek kości obliczono dzieląc całkowitą masę przez objętość próbki, obliczoną na podstawie pomiaru średnicy i długości suwmiarki
[więcej w: kariotyp osoby z zespołem downa, fishing24, nova krova ]
[hasła pokrewne: pijalnia wódki i piwa kraków, trufla kraków, nova krova ]