Neutrofilowa kinaza białkowa C jako mediator urazu po reperfuzji ad 8

Po godzinie inkubacji w inkubatorze z nawilżonym CO2 w temperaturze 37 ° C wstawki usunięto, a liczbę neutrofili, które migrowały do dna studzienek, określono za pomocą analizy FACS. Równoległe próbki studzienek obciążonych zawiesiną bez wkładek zostały włączone w celu określenia maksymalnej intensywności sygnału z liczby komórek załadowanych do insertów Transwell. Wydzielanie anionu ponadtlenkowego (O2a) mierzono za pomocą testu redukcji cytochromu c przy użyciu 20 ng / ml TNF-a. (BD Biosciences) i 10 & M; M fMLP lub 100 nM PMA jako bodziec (51). Degranulację stymulowaną przez fMLP (10 .M) lub PMA (100 nM) określono przez uwolnienie specyficznego granulatu znacznika laktoferyny z użyciem anty-ludzkiego laktoferyny Ab (Sigma-Aldrich) za pomocą testu ELISA (52). Liczba krwinek. Krew pobierano przez dekapitację, a profile próbek krwi analizowano za pomocą licznika komórek HEMAVET 850 (CDC Technologies Inc., Oxford, Connecticut, USA). Histologiczne wykrywanie neutrofili w mózgu. Mózgowe neutrofile wykrywano zgodnie z opisem (21). Koronalne wycinki mózgu zawierające prążkowie utrwalono w 10% obojętnej buforowanej formalinie (Sigma-Aldrich) i zatopiono w parafinie. Tkankę pocięto na seryjne sekcje o grubości 7- i; m, zamontowano na standardowych szkiełkach mikroskopowych, odparafinowano i inkubowano w roztworze zawierającym Naphesol AS-D i szybkobłękitną sól (Sigma-Aldrich), aby ujawnić obecność aktywności esterazy chlorooctanowej. Skrawki wybarwiono kontrastowo z czerwonymi jądrami (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA). Neutrofile w korze i prążkowiu zostały zliczone przez ślepego obserwatora za pomocą bezstronnego próbkowania mikroskopowego (optyczny dysektor) w czterech szeregach, ale nieprzylegających, reprezentujących jeden, o grubości około 0,5 mm, przekrój koronalny z regionu przodomózgowia (współrzędne bregma wynosiły w przybliżeniu 0. 1) dla każdego zwierzęcia. Próbki pobrano w mikroskopie Nikon Eclipse E600, stosując obiektyw × 40. Neutrofile w naczyniach krwionośnych nie zostały policzone. Przeszczep szpiku kostnego. Przeszczep szpiku kostnego wykonano przez dożylne wstrzyknięcie szpiku kostnego dawcy do lewostronnej zatoki oczodołu (52). Zawiesiny szpiku kostnego przygotowano z komórek wypłukanych z kości udowych dawców (w wieku 2-5 miesięcy). Osobom biorącym udział w badaniu (w wieku 5. 8 tygodni) podano śmiertelne dawki promieniowania całego ciała z dwiema ekspozycjami w odstępie 3 godzin do 6 Gy ze źródła 137Cs. Napromienionych biorców uratowano przez wstrzyknięcie zawiesiny szpiku kostnego (5 x 106 komórek w 0,3 ml) od dawców w ciągu godziny po napromieniowaniu. Polimyksyna B (120 U / ml, Sigma-Aldrich) i neomycyna (0,6 mg / ml, Sigma-Aldrich) dodano do wody pitnej dla przeszczepionych myszy przez 20 dni po transplantacji w celu stłumienia patogenów. Analiza statystyczna. Dane ilościowe wyrażono jako średnią plus lub minus SEM. Do oceny istotności statystycznej zastosowano jedno-, dwu- lub trójdrożną ANOVA z testami post-hoc Bonferroniego lub Newmana Keulsa lub dwustronne niesparowane testy Student. We wszystkich testach wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. PodziękowaniaTo dzieło było wspierane przez granty NIH DK-58066 (CA Lowell), NS-35902 (DM Ferriero), AA-13588 (RO Messing), a także przez fundusze dostarczane przez stan Kalifornia na badania medyczne nadużywania alkoholu i substancji przez Uniwersytet Kalifornijski w San Francisco (UCSF; RO Messing). Dziękujemy D. Wangowi, J. Dadgarowi, S. Taylorowi i J. Connolly za wsparcie techniczne oraz TN Mayadas (Harvard Medical School), N. Deruginowi i A. Sheldonowi (UCSF) za porady techniczne. Przypisy Niestandardowe skróty: przednia tętnica mózgowa (ACA); wspólna arteria tętnic szyjnych (CCA); diacyloglicerol (DAG); peptyd formyl-Met-Leu-Phe (fMLP); wewnętrzna tętnica szyjna (ICA); antygen funkcyjny leukocytów (LFA-1); tętnica środkowa mózgu (MCA); niedrożność środkowej mózgowej okluzji (MCAO); kinaza białkowa C (PKC); tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA); Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoliowy (TTC). Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
[patrz też: moja historia odchudzania, legato motocykle, grudziądz jednostka wojskowa ]
[patrz też: papryczki 5, motochemia, deccoria galerie ]