Neutrofilowa kinaza białkowa C jako mediator urazu po reperfuzji ad 7

Mapowanie anatomii naczyń mózgowych przeprowadzono zgodnie z opisem (44). Atrament wodoodporny Higgins Black Magic (200. 250. L, Sanford Corp., Bellwood, Illinois, USA) został wstrzyknięty do lewej komory przy użyciu igły 26 G i prawe przedsionek został rozcięty, aby uwolnić ściek. Myszy zdekapitowano, a głowy zanurzano w 10% obojętnej buforowanej formalinie (Sigma-Aldrich) przez 3-4 dni. Mózgi zostały starannie usunięte z czaszek i zobrazowane. Punkty zespolenia między przednią tętnicą mózgową (ACA) i MCA zostały zlokalizowane przez śledzenie obwodowych gałęzi tych naczyń. Sąsiednie punkty anastomotyczne zostały połączone, aby zidentyfikować linię anastomoz,. który reprezentuje granicę terytoriów ACA i MCA. Odległości od linii środkowej do linii zespoleń mierzono w płaszczyznach czołowych 2, 4 i 6 mm od bieguna czołowego. Kapilary mózgowe barwiono za pomocą histochemii dezoksyazą NADPH, która ujawnia zarówno śródbłonkowe, jak i neuronalne NOS w mózgu gryzonia. Dokonano tego przez utrwalenie utrwalonych formaldehydem skrawków tkanki przez noc w 2% aldehydem glutarowym w PBS w temperaturze 4 ° C, przepłukanie ich w PBS i inkubację w NADPH (0,5 mg / ml; Sigma-Aldrich), nitroblue tetrazolium (0,2 mg). / ml; Sigma-Aldrich) i 0,3% Triton X-100 w PBS przez 4 godziny w 37 ° C. Immunohistochemia. Mózgi przetwarzano zgodnie z opisem (45). Przekroje wieńcowe inkubowano przez noc z pierwszorzędowym Ab (kozim poliklonalnym Ab rozpoznającym koniec C szczurzego PKCa (1: 1000 x 1500, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA) lub mAb (1: 1500 , BD Biosciences, San Diego, Kalifornia, USA) wytworzone z użyciem peptydu składającego się z aminokwasów 114 (289 ludzkiego PKCa, kodowanego przez egzonus 5 [10 ludzkiego genu PKCa (ENST00000330452), co odpowiada egzonom 4 Y9 genu mysiego (ENSMUSG00000021948; NCBIm32) .Przeciwciała drugorzędowa to biotynylowane osiołowe anty-kozie lub przeciwciało anty-mysie (1: 300; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA). 2 godziny z drugorzędowym Ab przeprowadzono inkubację w kompleksie peroksydazy ExtrAvidin (Sigma-Aldrich), 1: 3000 w PBS, przez 2 h. Aktywność peroksydazy wizualizowano histochemicznie za pomocą diaminobenzydyny.Szkupy badano przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse E600 wyposażonego w Cyfrowa kamera kolorowa Spot II rybitwy barwiące w mózgach myszy WT. Specyfika PKC. Ab dla PKC myszy. została zweryfikowana przy użyciu tkanki uzyskanej z myszy N PKCa, w których nie było immunobarwienia. W doświadczeniach kontrolnych pominięcie pierwszorzędowych Ab spowodowało brak barwienia immunologicznego. Analiza Western blot. Lizaty białkowe poddano SDS-PAGE. Po blottingu membrany nitrocelulozowe sondowano mAbs wobec PKCa, PKCy i PKCa. (BD Transduction Laboratories, San Diego, Kalifornia, USA), które stosowano w rozcieńczeniach odpowiednio 1: 500, 1: 1000 i 1: 250. Królik poliklonalny przeciwko PKC. (Santa Cruz Biotechnology Inc.) zastosowano w 0,5 . g / ml. Królik poliklonalny przeciwko PKC. (SN134) zastosowano przy 1: 2000 (46). Immunoreaktywne prążki zostały określone ilościowo za pomocą skanowania densytometrycznego. Przeprowadzono liniową analizę regresji stężenia białka i odpowiednich wartości gęstości, a objętość każdego izozemu wyrażono jako nachylenie odpowiedniej linii regresji (47). Adhezja neutrofilowa, migracja, O2. uwalnianie i degranulacja. Neutrofile izolowano przez wirowanie w gradiencie gęstości Percoll ze szpiku kostnego myszy, jak opisano (48). Testy adhezji przeprowadzono na 96-studzienkowych płytkach Falcon (BD Discovery Labware, Boston, Massachusetts, USA) pokrytych 20% FCS (49). Oczyszczone neutrofile znakowano fluorescencyjnie kalceiną AM (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA) i inkubowano w studzienkach przez 30 minut w 37 ° C z chemoatraktantami 12-mirystynianem forbolu, 13-octanem (100 nM; Sigma-Aldrich ), fMLP (1 (M, Sigma-Aldrich) i IL-8 (200 ng / ml, Sigma-Aldrich). Całkowitą liczbę komórek zmierzono przez wykrywanie fluorescencji przy użyciu czytnika płytek fluorescencyjnych Cytofluor II (PerSeptive Biosystems, Framingham, Massachusetts, USA) przy wzbudzeniu 485-nm i długości fali emisji 530 nm. Płytki następnie przemyto kilka razy w celu usunięcia nieprzylegających komórek i zmierzono fluorescencję pozostającą na płytkach. Stopień adhezji komórek wyrażono jako procent obliczony przez podzielenie ilości fluorescencji po przemyciu przez ilość fluorescencji przed płukaniem. Test chemotaksji neutrofili (test migracji in vitro) przeprowadzono jak opisano (50). Wkładki Transwell (membrany poliwęglanowe o rozmiarach porów 5- i m; Corning Inc., Corning, New York, USA) napełniono neutrofilami w zawiesinie i umieszczono w pożywkach zawierających wskazane stężenia IL-8 w 24-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowej.
[hasła pokrewne: pijalnia wódki i piwa kraków, motochemia, trufla kraków ]
[przypisy: bałkanica kraków, no game kraków, u romana kraków ]