Neutrofilowa kinaza białkowa C jako mediator urazu po reperfuzji ad 6

Hamowanie PKC. w nienaruszonych sercach szczurzych ex vivo zmniejsza również uraz z powodu niedokrwienia i reperfuzji; nie obejmuje to neutrofili PKCa, ponieważ serca są poddawane perfuzji tlenowym buforem pozbawionym komórek krwi (39). Ponadto uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne mięśnia sercowego jest podobne u myszy WT iu myszy z niedoborem oksydazy NADPH, podczas gdy istotne różnice obserwuje się w urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym mózgu pomiędzy tymi genotypami (28). Wzięte razem z naszymi wynikami, te odkrycia wskazują wyjątkową rolę dla neutrofili PKC. w urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym mózgu. Rodzi to intrygującą możliwość, że PKC. Inhibitory mogą być użyteczne jako dodatki do leczenia fibrynolitycznego ostrego udaru w celu zmniejszenia ryzyka urazu reperfuzyjnego i ewentualnie wydłużenia okresu czasu, w którym leki takie jak t-PA można bezpiecznie podawać. Metody Wytwarzanie myszy N-PKC. PKC. zmutowane myszy uzyskano przez rekombinację homologiczną z użyciem wektora kierującego kodującego sekwencje loxP flankujące ekson 3 mysiego PKC. gen (ENSMUSG00000021948; NCBIm32), który wprowadzono do komórek ESS 129SvJ (Figura 1A). Exon 2 zawiera kodon startowy translacji. Rekombinowane komórki następnie transfekowano plazmidem pPac-CRE (40), a klony komórek ES pozbawione eksonu 2 zidentyfikowano za pomocą analizy typu Southerna i PCR. Hybrydowe potomstwo chimerycznych myszy z pokolenia F1 C57B1 / 6J x 129 / SvJ skrzyżowano w celu wytworzenia hybrydowego WT i hybrydy pokolenia F2. mutanci z miotu na studia. O ile nie podano inaczej, użyliśmy myszy obu płci. Eksperymentalne myszy karmiono standardową karmą laboratoryjną ad libitum. Procedury dotyczące opieki nad zwierzętami i postępowania z nimi zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje ds. Opieki nad zwierzętami i ich użytkowania w University of California w San Francisco i Gallo Center zgodnie z wytycznymi NIH. Ogniskowe niedokrwienie mózgu. Procedura chirurgiczna mająca na celu indukcję ogniskowego niedokrwienia mózgu jest modyfikacją opartą na opublikowanym protokole (41). Myszy o wadze 25. 35 g znieczulono 3% izofluranem w 100% O2. Po indukcji znieczulenia izofluran został zredukowany do 1,5% i utrzymany. Temperaturę ciała utrzymywano na poziomie 35,5. 37 ° C z podkładką grzejną podczas zabiegu chirurgicznego. Nylonowy sznurek monofilamentowy 5-0 zaokrąglony na końcu został wprowadzony do zewnętrznej tętnicy szyjnej i wysunięty o 9,0. 10 mm w tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) powyżej rozwidlenia wspólnej tętnicy szyjnej (CCA) do proksymalnego MCA. Po 60 minutach zgryzu szew został usunięty z CCA w celu wywołania reperfuzji. Po 24 godzinach reperfuzji myszy uśmiercano do badania. Niektóre myszy poddano trwałemu MCAO przez pozostawienie szwu w ICA przez 20 godzin. Regionalny mózgowy przepływ krwi. Regionalny mózgowy przepływ krwi mierzono metodą przepływomierza laserowo-dopplerowskiego z sondą (Vasamedics Inc., St. Paul, Minnesota, USA) umieszczoną na czaszce 1,5 mm poprzecznie do linii pośrodkowej i 2 mm do tyłu do bregmy. Względne pomiary przepływu krwi w mózgu wykonano w trzech różnych okresach: po znieczuleniu, w 1-godzinnym okresie MCAO i podczas pierwszej godziny reperfuzji. Dane wyrażono jako stosunek intensywności sygnału dopplerowskiego w półkuli niedokrwiennej w porównaniu z drugą półkulą kontralateralną. Niedobory neurologiczne. Badania neurologiczne wykonano 20 godzin po indukcji ogniskowego niedokrwienia mózgu za pomocą czteropoziomowego systemu ocen: 0, brak obserwowanego deficytu neurologicznego (prawidłowy); 1, niezdolność do chodzenia prosto (łagodny); 2, krąży w kierunku strony paretic (umiarkowane); 3, spadające na stronie paretic (umiarkowane-ciężkie); 4, utrata odruchu prostującego (poważny) (20). Określenie rozmiaru zawału. Po ogniskowym niedokrwieniu mózgu myszy uśmiercano, a mózgi szybko usuwano i krojono wieńcowo w odstępach mm. Wycinki mózgu inkubowano przez 20 minut w 2% chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliowym (TTC, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) w PBS. Plamkowane plastry utrwalono w 10% obojętnej buforowanej formalinie (Sigma-Aldrich) do zobrazowania. Plastry mózgu zostały sfotografowane przy użyciu mikroskopu Leica M420 wyposażonego w kolorową kamerę wideo Sony 3CCD. Ślepy obserwator mierzył obszary niedokrwienne i normalnej kontralateralnej części mózgu, śledząc kontury tych regionów na ekranie komputera za pomocą oprogramowania NIH Image 1.6.1. Obszar zawału wyrażono jako procent przeciwległej połowy mózgu w celu wyeliminowania wpływu obrzęku na obliczenia (42, 43). Całkowity obszar zawału został obliczony poprzez podzielenie sumy obszarów zawału przez sumę przeciwległych obszarów półkuli mózgu. Wizualizacja anatomii naczyń mózgowych
[hasła pokrewne: biustonosz sportowy nike, maseczka na włosy z siemienia lnianego, królestwo pierożka ]
[patrz też: deli 8, well done kraków, motochemia kraków ]