Interakcje selektynowo-mucynowe jako prawdopodobne wyjaśnienie molekularne dla związku zespołu Trousseau z śluzowymi gruczolakorakami czesc 4

Na odcinku tkanki, 20 losowych pól przy 200-krotnym powiększeniu zostało przechwyconych cyfrowo i poddanych histograficznemu określeniu ilościowo oznaczonych immunofluorescencyjnie (CD41-Cy3) płytek dodatnich pikseli przy użyciu Adobe Photoshop (64). Testy pełnej krwi. Krew pełną pobierano bezpośrednio przez nakłucie serca w probówkach zawierających Refludan (50 .g / ml, końcowe). Pięćdziesiąt mikrolitrów krwi mieszano (około 1000 obrotów na minutę, 37 ° C) w silikonowanych kuwetach z mieszadłami magnetycznymi (Crono-Log Corp.). Pięć mikrolitrów rozcieńczonych badanych związków dodano do mieszanej krwi i pozostawiono do wymieszania przez 5 minut. Reaktywowana krew (2. L) została następnie rozcieńczona do 20. L soli buforowanej HEPES zawierającej sprzężoną z biotyną szczurzą anty-mysią P-selektynę (CD62P) (końcowe 5. G / ml), sprzężonego z FITC szczurzego anty-mysiego CD41 ( BD PharMingen) (końcowe stężenie 5 ug / ml) i streptawidyna-Rfikoerytryna (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) (końcowe stężenie 5 ug / ml). Etapy znakowania przeprowadzono sekwencyjnie przez statyczną inkubację (15 minut, RT). Niezmodyfikowaną, rozcieńczoną, znakowaną krew natychmiast analizowano za pomocą cytometrii przepływowej i wyniki analizowano za pomocą oprogramowania CellQuest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California, USA). Płytki krwi bramkowano za pomocą fluorescencji FITC i określano procent komórek P-selektyny (CD62P-PE). Wyjściową ekspresję P-selektyny uzyskaną z użyciem traktowanych PBS kontroli odjęto jako tło. Dane uznano za znaczące, gdy wyjściowy poziom wynosił mniej niż 10% płytek z domieszką CD41-FITC. Analiza statystyczna. Dane wyrażono jako średnią plus lub minus błąd standardowy średniej. Porównania wykorzystały test ucznia. Wyniki Oczyszczanie fragmentów mucyny dużego raka. Wczesne raporty (44, 45) i niektóre podręczniki medyczne sugerują, że mucyny nowotworowe mogą inicjować koagulację przez bezpośrednią aktywację czynnika X. Jednakże, skażenie przez TF i / lub inne cząsteczki bioaktywne prawdopodobnie wprowadziło w błąd takie badania (D. Le i S. Rapaport, niepublikowane obserwacje). Nie jest to zaskakujące, ponieważ nienaruszone mucyny są dużymi złożonymi cząsteczkami, które mogą łączyć niekowalencyjnie z wieloma lipidami i białkami pochodzącymi z tkanek. Proteolityczne fragmenty mucyn są często uwalniane do krwi przez komórki nowotworowe, a silnie glikozylowane domeny mucyn są oporne na proteazy z powodu osłaniania przez zgrupowane O-glikany (22. 24, 65). Korzystając z odporności na proteazę, opracowaliśmy nowatorską metodę oczyszczania dużych fragmentów mucyny z ksenoprzeszczepionych nowotworów, definiowanych jako domeny większe niż 200 kDa dostatecznie glikozylowane, aby chronić je przed działaniem proteazy o szerokim spektrum działania. Uzasadnieniem ogólnego podejścia było wyeliminowanie wszystkich zanieczyszczających lipidów i polipeptydów, w tym cząsteczek prokoagulantów, takich jak fosfolipidy, czynnik aktywujący płytki krwi i TF. Również produkt końcowy byłby mieszaniną proteolitycznych fragmentów różnych polipeptydów mucyny, podobnych do wydzielanych przez naturalnie występujące raki. Jak opisano w Methods, pełna procedura obejmowała ekstensywną ekstrakcję lipidów i trawienie proteazą o szerokim spektrum działania, a następnie inne terapie enzymatyczne w celu usunięcia dużych cząsteczek polianionowych, takich jak glikozoaminoglikany i kwasy nukleinowe, i ewentualnie filtrację żelową w celu zebrania zachowanych dużych fragmentów mucyny. Analiza takiego materiału za pomocą elektroforezy żelowej, po której następuje detekcja węglowodanów barwnikiem PAS, wykazała prążek o wysokiej masie cząsteczkowej powyżej 200 kDa, który wszedł w żel 4% SDS (Figura 1a). Jak pokazano w Tabeli 1, skład chemiczny tych oczyszczonych preparatów mucyny nowotworowej był zgodny z oczekiwaniami dla mucyn. Preparaty zawierały zazwyczaj około 30% aminokwasu i około 60% wagowych węglowodanów. Analiza aminokwasowa wykazała wzbogacenie w serynę, treoninę i prolinę, wszystkie charakterystyczne dla mucyn. Monosacharydowa analiza składu wykazała również profil charakterystyczny dla O-glikanów, z dominacją N-acetylogalaktozaminy i prawie nieobecności mannozy. Kwasy sialowe stanowiły około 15% całkowitej masy węglowodanów, a siarczan przyczynił się do około 1,5% całkowitej wagi. Analiza ta wykazała również brak potencjalnych zanieczyszczeń, takich jak glikozoaminoglikany macierzy pozakomórkowej (kwas glukuronowy i kwas iduronowy), kwasy nukleinowe (brak rybozy i deoksyrybozy) i LPS (brak KDO i heptozy). Figura Oczyszczone preparaty mucyny są duże i zachowują zależne od wapnia miejsca wiążące dla wszystkich trzech selektyn. (a) 4% żel SDS-PAGE z wykrywaniem węglowodanów przez odczynnik PAS. (b) ELISA, w której unieruchomione preparaty mucyny są sondowane rekombinowanymi, rozpuszczalnymi sele-nami mysimi
[podobne: moja historia odchudzania, fishing24, węglowodany złożone tabela ]
[hasła pokrewne: królestwo pierożka, pompon komis, pijalnia wódki i piwa kraków ]