Interakcje selektynowo-mucynowe jako prawdopodobne wyjaśnienie molekularne dla związku zespołu Trousseau z śluzowymi gruczolakorakami cd

Frakcję objętości pustej przestrzeni dializowano jak opisano powyżej, liofilizowano, ważono i przechowywano w temperaturze <80 ° C. Charakterystyka mucyny. SDS-PAGE przeprowadzono przy użyciu 3% spiętrzania i 4% żelu rozdzielającego. Żele barwiono metodą kwasu nadjodowego Schiffa (PAS) (61). Analizę aminokwasów przeprowadzono w rdzeniu wiertniczym University of California, San Diego (UCSD) przez hydrolizę 6 M HC1 przez 60 minut w 160 ° C w zamkniętych probówkach, wysokosprawną chromatografię kationowymienną sodu (kolumna Pickering Labs) z użyciem cytrynianu sodu układ buforowy, derywatyzacja ninhydryną postkolumną i piki detekcyjne przy 500. 570 nm, z zastosowaniem norleucyny jako wzorca wewnętrznego. Analizę monosacharydów przeprowadzono za pomocą wysokowydajnej chromatografii anionowymiennej z pulsacyjną detekcją amperometryczną w UCSD Glycotechnology Core Facility (http://grtc.ucsd.edu/glycocore.html). Zawartość kwasu sialowego oznaczono metodą HPLC z odwróconymi fazami pochodnych 1,2-diamino-4,5-metylenodioksybenzenu (62). Zawartość siarczanu określono przez analizę IC po pirolizie w UCSD Glycotechnology Core Facility. Aktywność wiązania selektyny określono metodą ELISA, jak opisano wcześniej (35). Preparaty mucyny (500 ng / studzienkę) opłaszczono na płytkach ELISA przez noc w 4 ° C w buforze do powlekania ELISA (50 mM węglan / wodorowęglan sodu, pH 9,5). Rozpuszczalne rekombinowane mysie chimery Fc chimerowych P-L, E-selektyny / ludzkiej IgG poddano wstępnej ekstrakcji kozim przeciwciałem przeciw ludzkiej IgG (BioRad Laboratories Inc., Hercules, Kalifornia, USA) w buforze ELISA (20 mM HEPES, 125 mM NaCl; 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 1% BSA, 0,1% NaN3, pH 7,4) przez godzinę w temperaturze pokojowej z kołysaniem i mieszaninę wystawiono na działanie opłaszczonych studzienek przez noc w 4 ° C. Po przemyciu wykrywano wiązanie z substratem pnp-fosforanu. Testy krzepnięcia. Różne stężenia mucyny dodano do cytrynianowego osocza ludzkiego, które następnie ponownie zmielono w celu zbadania pod kątem zanieczyszczenia TF za pomocą koagulometru (Diagnostica Stago Inc., Parsippany, New Jersey, USA), który wykrywa tworzenie fibryny. Standardowa krzywa dodanego TF (Dade Innovin, Baxter Healthcare Corp., Deerfield, Illinois, USA) ustaliła, że czułość testu dla odpowiedzi krzepnięcia na TF była w zakresie subnanogramu. Oznaczenia agregometryczne płytek (Chrono-Log Corp., Havertown, Pennsylvania, USA) przeprowadzono na hirudynowanym osoczu bogatopłytkowym (PRP) z użyciem mucyny i / lub ADP, kwasu arachidonowego, epinefryny i kolagenu (Bio / Data Corp., Horsham, Pensylwania, USA) (63). Testy pirogenności. Jednojądrzaste komórki (MNC) wyizolowano z pulowanej cytrowanej mysiej krwi przez izopikroskopowe odwirowanie za pomocą Ficoll-Paque medium rozdzielczego o stopniu badawczym (Pharmacia Biotech AB). MNC (2 x 106 MNC / ml RPMI, Gibco 11875-093) hodowano z lub bez mucyny (2. 500. G / m). Po 20 godzinach inkubacji supernatant badano pod kątem wydzielania IL-6 przez kanapkowy test ELISA z użyciem zestawu BD PharMingen (San Diego, Kalifornia, USA). LPS (Sigma-Aldrich) zastosowano jako wzorzec odniesienia i wykazano czułość testu na około 0,001 endotoksyny U / ml. Mucin nie był dodatni w tym teście, a także nie hamował aktywności LPS. Należy zauważyć, że 100 .g mucyny i 2 x 106 MNC / ml w przybliżeniu odpowiada stężeniu oczekiwanemu w badaniach in vivo. Badania in vivo. Liofilizowaną oczyszczoną mucynę rozpuszczono w PBS do hodowli tkankowych (Invitrogen Corp., Grand Island, New York, USA) i wstrzyknięto (50. 400. G / 100. L) do bocznej żyły ogonowej myszy znieczulonych izofluranem (VEDCO Inc ., St. Joseph, Missouri, USA). Heparynę (Fujisawa Healthcare Inc., Deerfield, Illinois, USA) przy 100 jednostkach Farmakopei Stanów Zjednoczonych na mysz (35) wstrzyknięto 15 minut przed wstrzyknięciem mucyny. Hirudin (Refludan, Aventis Pharmaceuticals Inc., Bridgewater, New Jersey, USA) przy stężeniu 50 .g / mysz został wspólnie z mucyną. W niektórych eksperymentach mysią trombinę (Sigma-Aldrich) zliczono (0,001. 0,05 U / mysz) z mucyną. Histologia. Morfologię płuc zachowano u eutanizowanych myszy przez perfuzję dotchawiczą mieszaniny 1: objętościowo / objętościowo PBS i podłoża do histologicznego osadzania (związek Tissue-Tek OCT, Sakura Finetek, Torrance, Kalifornia, USA) przed otwarciem jamy klatki piersiowej. Krioskrawki utrwalone w acetonie (5 .m) zostały zablokowane w 10% surowicy królika, inkubowane z owczą przeciwludzką fibryną (ogen) (BIODESIGN International Inc., Saco, Maine, USA) (PBS, 1% BSA, 0,1% NaN3, 4 ° C, przez noc), sprzężone z FITC królicze anty-owcze IgG ciężkie i lekkie łańcuchy (H & L), oczyszczone szczurze przeciwmysie CD41 (BD PharMingen), skoniugowane z AffiniPure Cy3 przeciw-szczurze IgG (H & L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) i montowane z medium montażowym Vectashield zawierającym DAPI (Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, USA)
[podobne: grudziądz jednostka wojskowa, globulki dopochwowe przeciwzapalne, skierowanie do szpitala psychiatrycznego ]
[hasła pokrewne: motochemia, deccoria galerie, genji sushi ]