Interakcje selektynowo-mucynowe jako prawdopodobne wyjaśnienie molekularne dla związku zespołu Trousseau z śluzowymi gruczolakorakami ad

Podczas gdy wszystkie trzy selektyny rozpoznają strukturalnie pokrewne ligandy zawierające kwas sialowy i reszty fukozy, optymalne tworzenie ligandów dla selekty L i P wymaga również specyficznie zlokalizowanych estrów siarczanowych (46. 48, 50. 53). My i inni wykazaliśmy, że heparyna może hamować rozpoznawanie ligandów (54-59) przez P- i L-selektynę, a blokowanie heparyny przerzutów nowotworowych jest przynajmniej częściowo wyjaśnione przez hamowanie selektyny, a nie przez jej aktywność przeciwzakrzepową (35, 36, 60). Zakładamy, że te mucyny komórkowe pośredniczą w bezpośrednich interakcjach między komórkami nowotworowymi a komórkami krwi zawierającymi selektynę. Biorąc pod uwagę wszystkie powyższe informacje, postawiliśmy hipotezę, że interakcje P-selektyny z mucynami krążących raków mogą być zaangażowane w zespół Trousseau. Tak więc, ślady TF pochodzącego z raka mogą słabo aktywować kaskadę krzepnięcia, wytwarzając trombinę, która następnie aktywuje płytki, powodując ekspresję P-selektyny. Mucyny raka mogą wtedy działać jako matryce do agregacji aktywowanych płytek krwi za pomocą P-selektyny. W teście tej hipotezy, w której dożylnie wstrzyknięto myszom myszy z mucyną bez TF, stwierdziliśmy, że formowanie mikroukładów bogatych w płytki zależało nie tylko od P-selektyny, ale także od selektyny L pochodzącej z leukocytów. Co więcej, może ona występować niezależnie od wytwarzania trombiny. Podobne wyniki uzyskano przy użyciu badań in vitro krwi pełnej. Pokazaliśmy, wierzymy po raz pierwszy, że L-selektyna i P-selektyna są zaangażowane w liniową ścieżkę reaktywną wyzwalaną przez mucyny. Nasze dane mogą wyjaśnić klasyczną mikroangiopatyczną prezentację zespołu Trousseau związanego z nowotworami produkującymi mucynę oraz wyższość terapii heparyną nad antagonistami witaminy K w takich przypadkach. Metody Komórki i myszy. Ludzkie komórki gruczolakoraka okrężnicy LS180 (ATCC CL 187, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) hodowano w. MEM zawierającym 10% FBS. Immunodeficient RAG2. /. myszy (129S6 / SvEvTac-Rag2tm1, Taconic Farms, Germantown, New York, USA) i typu dzikiego (C57bl / 6J), z niedoborem P-selektyny (P-selA / y) (B6; 129S-SelptmpHyn), i Próby myszy z niedoborem L-selektyny (L-sel2 / a) (B6; 129S-SelltmlHyn) otrzymano z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA) i krzyżowano w celu uzyskania niedoborów selektyny w jednolitych podłożach genetycznych (C57bl / 6J przez co najmniej siedem pokoleń), w tym P-sel. /. / L-sel. /. myszy z podwójnie niedoborem (35). Oczyszczanie fragmentów mucyny raka. Ksenoprzeszczepowe nowotwory (0,2. 0,8 g mokrej masy, 1. 1,5 cm średnicy) wytworzono przez podskórne wstrzyknięcie 2 x 106 LS180 komórek / miejsca do RAG2. /. myszy. Połączone guzy (15-30 g mokrej masy) otrzymane po około 2,5 tygodniach homogenizowano w 50 ml wody i odwirowywano (10 000 g, 4 ° C, 10 minut) w celu usunięcia nierozpuszczalnych resztek. Rozpuszczalne mucyny w supernatancie wytrącono przez dostosowanie do pH 5,0, stosując 100 mM HC1 dodanego w kroplach, mieszając przez 30 minut na lodzie. Pelet białkowy rozpuszczono ponownie w 25 ml jałowej wody zawierającej 0,01% azydku, roztwór doprowadzono do pH 7,0 dodając 100 mM NaOH w kroplach i poddano dwóm ekstrakcjom organicznym, stosując metanol / chloroform (1: obj./obj.) W końcowej fazie. stosunek 1: vol / vol. Fazę wodną doprowadzono do 25 ml za pomocą 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 100 mM EDTA, 0,01% NaN3 i wielokrotnie traktowano albuminą Tritirachium proteinaza K (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) w 65 ° C. (0,25 U / ml końcowe za każdym razem, najpierw przez noc, a następnie dwie obróbki przez 6 godzin każda). Mieszaninę reakcyjną gotowano przez 15 minut w celu inaktywacji pozostałego enzymu, a następnie czterokrotnie dializowano (odcięcie masy cząsteczkowej, 12 .14 kDa) wobec 80 obj. Wody zawierającej 0,01% azydku. Mieszaninę doprowadzono do 50 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 0,01% azydku, pH 7,4 i poddano działaniu heparynazy II Flavobacterium heparinum (końcowe, 0,075 U / ml, Sigma-Aldrich) i Proteus. chondroitynaza vulgaris ABC (końcowe, 0,015 U / ml, Sigma-Aldrich) przez 6 godzin w 37 ° C i gotowane przez 15 minut. Następnie mieszaninę potraktowano dwukrotnie DNazą (75 U / ml, Invitrogen Corp., San Diego, Kalifornia, USA) i RNazą (0,01 mg / ml; Invitrogen Corp.) przez 2 godziny w 37 ° C, a następnie jedną ostateczną proteinazę. Trawienie K, jak opisano powyżej. Mieszaninę następnie gotowano przez 15 minut, dializowano cztery razy wobec wody, jak opisano powyżej, i liofilizowano. Zachowane duże fragmenty mucyny zebrano następnie jako frakcję o objętości większej niż 200 kDa za pomocą chromatografii z wykluczeniem rozmiarów (Sephacryl HR-S-200, 1,5 cm x 95 cm, Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Szwecja) w buforze izotonicznym (50 mM). Tris, 100 mM NaCl, 0,01% NaN3, pH 7,4, szybkość przepływu 0,3 ml / min, temperatura pokojowa [RT])
[hasła pokrewne: pijalnia wódki i piwa kraków, fishing24, pompon komis ]
[podobne: no game kraków, u romana kraków, papryczki 5 ]