Interakcje selektynowo-mucynowe jako prawdopodobne wyjaśnienie molekularne dla związku zespołu Trousseau z śluzowymi gruczolakorakami ad 5

Wartości reprezentują średnią. SEM; n = 5 pojedynczych preparatów mucyny. P, P-selektyna; L, L-selektyna; E, E-selektyna. Tabela Skład chemiczny oczyszczonych preparatów mucynowych z nowotworów ksenograftu LS180. Preparaty mucynowe są rozpoznawane przez selektyny w sposób zależny od wapnia. Wiadomo, że nienaruszone mucyny wyizolowane z heteroprzeszczepów gruczolakoraka LS180 są rozpoznawane przez wszystkie trzy selektyny w sposób zależny od wapnia (33). Aby ustalić, czy preparaty mucynowe z nowotworów zachowały funkcjonalne miejsca wiązania dla selektyny, przeprowadziliśmy testy ELISA, które ilościowo wiązały rekombinowane, rozpuszczalne mysie chimerki Ig-Fc myszy z preparatami mucyny w fazie stacjonarnej. Jak pokazano na Fig. 1b, mucyny zachowują zależne od wapnia miejsca wiązania dla wszystkich trzech selektyn. Ponadto, ustalono, że wartości IC50 preparatów mucyny (stężenie dające 50% hamowania) wiązania P-selektyny do fazy stacjonarnej Sialyl-Lewis X były zgodne pomiędzy poszczególnymi partiami (dane nie pokazane). Tak więc nowy sposób oczyszczania opisany tutaj w sposób powtarzalny daje preparaty mucyny o dużej masie cząsteczkowej, które są rozpoznawane przez wszystkie trzy selektyny w sposób zależny od wapnia. Preparaty mucyny nie aktywują szlaków krzepnięcia w fazie ciekłej. Preparaty mucynowe nie rozpoczęły krzepnięcia w zmodyfikowanym teście protrombiny przy użyciu normalnego ludzkiego osocza, co wskazuje na brak zanieczyszczającego TF (danych nie pokazano, czułość testu była w zakresie subnanogramu). Preparaty mucynowe również nie wpływały na aktywowane tromboplastyny częściowe i rozcieńczały testy jadu żmii Russella na normalnym osoczu, wykluczając wszelkie śladowe lipidy, które mogłyby wpływać na koagulację (dane nie przedstawione). Zatem, preparaty mucyny są wolne od TF i nie są anty-lub prokoagulacyjne w standardowych testach in vitro. Preparaty mucyn nie są pirogenne. Chociaż przez cały czas stosowano sterylne procedury, zanieczyszczenie mogło powstać z zastosowanych preparatów enzymatycznych lub z nieoczekiwanych źródeł. Zgodnie z oczekiwaniami dla dużych cząsteczek polianionowych, te fragmenty mucyny dały słabe wyniki fałszywie dodatnie w standardowym teście lizatu Limulus dla endotoksyny. Poszczególne partie mucyny badano przesiewowo pod kątem aktywności pirogennej przy użyciu bardziej czułego i swoistego testu na myszach MNC, w którym próbki lub kontrole dodawano do pożywki hodowlanej, z detekcją wydzielanej IL-6 20 godzin później przez kanapkowy test ELISA (66). Od wyników negatywnych w tych badaniach (dane nie pokazane), doszliśmy do wniosku, że preparaty mucyny nie są pirogenne. Preparaty mucyny nie aktywują płytek in vitro. Pokazaliśmy, że same preparaty mucyny raka nie aktywują płytek bezpośrednio in vitro (33,34). Jednak w obecności podprogowych poziomów trombiny, mucyny wzmacniały agregację płytek in vitro. Ten wpływ mucyny był zależny od wapnia i mógł być blokowany przez P-selektynę blokując Abs i także nie występował, gdy płytki krwi z P-selektyny A /. użyto myszy (34). Te wyniki uzyskano stosując przemyte płytki zawieszone w buforze izotonicznym. W celu zbadania płytek krwi w nieco bardziej fizjologicznych warunkach stosowaliśmy mieszany antybiotyk PRP z hirudyną (Refludan), nieodwracalnym i natychmiastowym inhibitorem trombiny pochodzącym z pijawki, który jest obecnie w użyciu klinicznym. W tych warunkach preparaty mucyny ponownie nie miały wpływu na agregację płytek krwi przy braku trombiny. Co więcej, nie zwiększały one agregacji w odpowiedzi na podprogowe poziomy innych agonistów płytek, takie jak ADP, adrenalina i kolagen (dane nie przedstawione). Tak więc, preparaty mucyny raka nie aktywują płytek krwi bezpośrednio pod nieobecność aktywnej trombiny. Dożylne wstrzyknięcie preparatów mucyny myszom generuje mikrourombi bogate w płytki. W przeciwieństwie do braku bioaktywności we wszystkich powyższych testach in vitro, preparaty mucynowe szybko wytworzyły śródmięśniowe mikroukłady wewnątrzkomórkowe (wykryte za pomocą anty-CD41, znacznika płytek krwi), gdy wstrzyknięto je dożylnie myszom. Mikroukłady te znaleziono w kilku tkankach, w tym w sinusoidach wątroby, kłębuszkach nerkowych, splocie naczyniówkowym mózgu i płucach. Ponieważ małe naczynia krwionośne płuc były najbardziej spójnymi miejscami agregacji płytek, określiliśmy ilościowo stopień akumulacji płytek w sekcjach płuc, wykonując zdigitalizowane zdjęcia i określając średnią liczbę pikseli pozytywnych dla CD41 na pole widzenia (Figura 2). Mikrothrombi bogate w płytki krwi obserwowano w ciągu 5 minut po pojedynczym wstrzyknięciu preparatu mucyny, a prawie połowa została rozdzielona po godzinie. Niektóre mikroukłady utrzymywały się jednak i nie w pełni ustępowały dopiero po 48 godzinach
[podobne: enterococcus faecalis w moczu, legato motocykle, maseczka na włosy z siemienia lnianego ]
[przypisy: trufla kraków, nova krova, pod norenami ]