Identyfikacja onkogenów fuzji kinaz w raku tarczycy wywołanym promieniowaniem popromiennym ad

Przeprowadziliśmy RNA-seq w 5 nowotworach bez znanych zmian, jak również w przypadku z fuzją RET / PTC3 jako kontrolą pozytywną, stosując 75X75 odczytywanych na końcu pary na Illuminie HiSeq2000. Wygenerowaliśmy średnio 150 milionów odczytów dla każdej próbki i dopasowaliśmy je do ludzkiego genomu (hg19) przy użyciu TopHat, który wykazał niezmiennie wysoką jakość bazową na mapowanych odczytach i pokryciu genów dla wszystkich próbek (Suplementowa Figura 1). Wykorzystaliśmy program Snowshoes do wyszukiwania fuzji genów (14), z którymi z powodzeniem zidentyfikowaliśmy RET / PTC3 w kontroli pozytywnej (Suplementalna Figura 2). Po rygorystycznym filtrowaniu dla głębokości odczytu i unikalnego dopasowania, wykryliśmy 16 fuzji somatycznych, które były specyficzne dla guza (tabela dodatkowa 2). Dla każdej domniemanej fuzji szukaliśmy odczytów wspierających odwrotną fuzję (np. AGK. BRAF do BRAF. AGK). Zidentyfikowaliśmy 3 fuzje somatyczne w 4 z 5 próbek o prawdopodobnych właściwościach onkogennych: z CREB3L2-PPARG, z kinazą acyloglicerolu. BRAF (AGK-BRAF) i 2 z wariantem ETS 6. Neurotroficzny receptor kinazy tyrozynowej, typ 3 (ETV6 -NTRK3). Synteza CREB3L2-PPARG zestawia eksony i 2 CREB3L2 z całą sekwencją kodującą PPARG (egzony 1. 6). CREB3L2-PPARG t (3; 7) (p25; q34) zidentyfikowano wcześniej w przypadku raka pęcherzykowego tarczycy (15). Guz niosący tę fuzję w naszej kohorcie wykazał 3,6-krotny wzrost poziomów mRNA PPARG w porównaniu z odpowiadającym mu normalnym. Przeciwnie, wszystkie inne nowotwory poddane RNA-seq wykazywały obniżone poziomy mRNA PPARG w porównaniu z odpowiadającą im prawidłową tkanką (Suplementowa Figura 3). Wszystkie fuzje kierowców zidentyfikowane przez RNA-seq walidowano przez sekwencjonowanie RT-PCR i Sanger (Figury 2 i 3 i Suplementarna Figura 3). Figura 2 Charakterystyka fuzji onkogenu ETV6-NTRK3 w raku tarczycy u dzieci. (A) Lokalizacja genomowa, struktura mRNA i białka oraz walidacja przez sekwencjonowanie Sanger onkogenu fuzyjnego NTRK3. Egzony 1. 4 ETV6 pokazano na niebiesko, a eksony 12. 18 NTRK3 pokazano na czerwono. PTK, kinaza tyrozynowa białka; SAM, sterylny. motyw. (B) Western blot komórek NIH3T3 przejściowo transfekowanych pustym wektorem lub pMSCV-ETV6-NTRK3. Komórki były pozbawione surowicy przez 24 godziny przed pobraniem. Komórki wyrażające ETV6-NTRK3 (3 miały wyższe poziomy pAKT, pMEK, pERK i cyklinę D1. tAKT, całkowita AKT; tMEK, całkowity MEK; TERK, suma ERK. (C) Zwiększony wzrost (* P <3 X 10 ~ 4 w porównaniu z transfekowanym wektorem) i tworzenie kolonii agaru w komórkach NIH-3T3 eksprymujących ETV6-NTRK3. Dane reprezentują średnią. SEM. Figura 3 Charakterystyka onkogenu fuzyjnego AGK-BRAF w raku tarczycy u dzieci. (A) Lokalizacja genomowa, struktura mRNA i białka oraz walidacja przez sekwencjonowanie Sanger w onkogenach fuzji BRAF. Exony i 2 AGK przedstawiono w kolorze brązowym, a eksony 8. 18 w BRAF pokazano na zielono. (B i C) Western blot komórek zubożonych w surowicę (B) NIH3T3 lub (C) COS7 przejściowo transfekowanych pLVX-AcGFP-N1 lub pLVX-AGK-BRAF-GFP. Komórki wyrażające AGK-BRAF miały silną indukcję pMEK i pERK. (D) Zwiększony wzrost (* P <3 X 10 ~ 3 w porównaniu z transfekowanym wektorem) i tworzenie kolonii agaru w komórkach NIH-3T3 eksprymujących AGK-BRAF. Dane reprezentują średnią. SEM. (E) Koncentryczne obrazowanie fluorescencyjne komórek COS7 transfekowanych pLVX-AGK-BRAF-GFP i zabarwionych MitoTracker. Dystrybucja zielonej fluorescencji zachodzi na siebie, ale nie jest kolokalizowana z rozdzielczością MitoTracker (czerwony). Scalone obrazy (dolny rząd) pokazują mitochondria otoczone zieloną fluorescencyjną obręczą (oryginalne powiększenie, × 252 [u góry i u dołu po lewej]; × 840 [u dołu po prawej]). Paski skali: 10 .m. (F) Domena kinazy BRAF jest skierowana w stronę cytozolu w komórkach transfekowanych AGK-BRAF. Western blotting lizatów mitochondrialnych frakcji komórek NIH3T3 stabilnie transfekowanych pLVX-AcGFP-N1 (GFP) lub pLVX-AGK-BRAF-GFP (AGK-BRAF) traktowanych proteinazą K. lub bez. Błony inkubowano z przeciwciałami przeciwko BRAF, heksokinazie 1, lub syntaza ATP. Wszystkie 3 białka, w tym białko fuzyjne AGK-BRAF-GFP, są widoczne w nietkniętych lizatach mitochondrialnych. AGK-BRAF jest zubożony przez proteinazę K, podobnie jak zewnętrzna heksokinaza białka związanego z mitochondriami 1, podczas gdy wewnętrzna syntaza ATP mitochondrialnego białka. nie jest. ETV6-NTRK3 aktywuje szlaki MAPK i PI3K i transformuje komórki NIH3T3. ETV6-NTRK3 powstaje z translokacji interchromosomalnej t (12; 15) (p13; q25), która zestawia eksony 1. 4 ETV6 z egzonami 12. 18 NTRK3, kinazy wcześniej niezwiązanej z rakiem tarczycy. Punkt przerwania wrodzonych włókniakomięsaka i wydzielniczych nowotworów sutka, które obejmują eksony 1. 5 ETV6 i 13. 18 NTRK3, różni się od ETV6-NTRK3 (16, 17). [hasła pokrewne: sos brokułowy do makaronu, biustonosz sportowy nike, operacje plastyczne piersi ] [patrz też: papryczki 5, motochemia, deccoria galerie ]