Identyfikacja onkogenów fuzji kinaz w raku tarczycy wywołanym promieniowaniem popromiennym ad 8

Osad ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w ml buforu HIM, a następnie w kolejnym cyklu 700 g i 10000 g wirowania. Osad ponownie zawieszono w buforze HIM, aby uzyskać frakcję mitochondrialną. Świeże izolowane mitochondria inkubowano z lub bez proteinazy K (10 .g / ml) w 4 ° C przez 10 minut. Trawienia zatrzymano przez dodanie 2 mM PMSF i buforu ładującego SDS-PAGE . dodanego przed elektroforezą. Mikroskopia konfokalna. Komórki COS7 wysiewano na szkiełka komórkowe i transfekowano pLVX-AcGFP lub pLVX-AGK-BRAF-AcGFP następnego dnia. Dwa dni później zabarwiono MitoTracker (Life Technologies), utrwalono w 4% PFA, przemyto PBS i osadzono w wektorze (Vector Laboratories). Obrazowanie konfokalne przeprowadzono za pomocą aparatu Leica TCS SP5-II z zastosowaniem obiektywu immersyjnego o mocy 63 x / 1,4NA. Linie laserowe stosowane dla każdego fluoroforu wynosiły 488 nm (GFP) i 594 nm (MitoTracker). Serialowe obrazy z-stąpiono w krokach 0,2-mikronowych, a poszczególne figury wybrano do figur. Para WGS o wysokiej masie cząsteczkowej ekstrahowano ze świeżo zamrożonych normalnych i nowotworowych tkanek z 5 eksponowanych na promieniowanie i 5 sporadycznych brodawkowatych raków tarczycy. DNA o odpowiedniej wielkości oczyszczono na żelu z krótko fragmentowanej biblioteki DNA, aby wykluczyć jakiekolwiek niewłaściwe fuzje DNA podczas budowy biblioteki. Biblioteki DNA o krótkim fragmencie zostały wygenerowane przy użyciu zestawu próbek DNA TruSeq Nano (nr katalogowy FC-121-4001, Illumina) zgodnie z protokołami producenta. Grupowanie bibliotek przeprowadzono na przyrządzie do generowania klastrów cBot (Illumina), zgodnie ze specyfikacjami producenta (nr kat. CT-402-4001). Sekwencjonowanie końca parzystego (długość odczytu 76 bp) przeprowadzono przy użyciu sekwenatora Hiseq 2500 (Illumina) przy użyciu najnowszej chemii (v3) dla zestawów odczynników o cyklu 200 cykli (nr katalogowy FC-402-4001). Bioinformatyka WGS Odczyty sparowane zostały dopasowane do ludzkiego genomu hg19 za pomocą Burrows-Wheeler Aligner (wersja 0.7.5). Średni. standardowe odchylenie zasięgu genomu wynosi 7,22. 0,60. Mutacje somatyczne wykryto za pomocą Varscan (wersja 2.3.2), a rearanżacje chromosomów somatycznych zidentyfikowano przy użyciu BreakDancer (wersja 1.1.2) (21). Tylko przegrupowania obejmujące partnerów, którzy byli co najmniej 50 kb, były brane do dalszej analizy. Strukturalne warianty zostały opisane za pomocą Refseq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/). Testy Manna-Whitneya-Wilcoxona zostały użyte do porównania liczby SNV lub rearanżacji pomiędzy 2 grupami. Dane z sekwencjonowania sparowanych końców zostały zdeponowane w archiwum odczytu sekwencji NCBI pod numerem dostępu SRA903315. Statystyka Do oceny wpływu transfekowanych onkoprotein na wzrost i testy tworzenia kolonii zastosowano test 2-biegunowy ucznia. Test Manna-Whitneya-Wilcoxona wykorzystano do porównania całkowitej liczby rearanżacji między narażonymi na promieniowanie i sporadycznymi PTC. Ten sam test zastosowano do porównania częstości somatycznych niesynonimicznych SNV pomiędzy 2 grupami. Dokładny test Fishera zastosowano do porównania częstości występowania onkogenów fuzyjnych w przypadkach narażonych na promieniowanie i sporadycznych. Bardziej szczegółowy opis zastosowanych analiz bioinformatycznych można znaleźć w Dodatkowych metodach. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. Zatwierdzenie badania Badanie przeprowadzono za zgodą NIH IRB, Bethesda, Maryland, USA (protokół nr 0H00-C-N024) oraz Komitetu Etyki Badań Imperial College (protokół nr ICREC-8-2-4). Materiały uzupełniające Zobacz Uzupełniające dane PodziękowaniaTa praca została wsparta przez NIH dotacje CA50706, CA72597, R01HG006798, R01NS076465 i R44HG005297; Fundacja Pulitzera Margot Rosenberg; fundusz Byrne; oraz Fundacja Rodziny Lefkofskich. Dziękujemy Doronowi Betel z Weill Cornell Medical College za jego niezwykłą pomoc w generowaniu danych WGS. Jesteśmy wdzięczni Chernobyl Tissue Bank za dostarczenie próbek pacjentów (numer projektu CTB 002/2009) oraz członkom Międzynarodowego Instytutu Patologii Banku Tkanek w Czarnobylu w celu potwierdzenia diagnoz: A. Abrosimov, TI Bogdanova, N. Dvinskikh , G. Fadda, J. Hunt, M. Ito, V. LiVolsi, J. Rosai i ED Williams. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2013; 123 (11): 4935. 4944. doi: 10,1172 / JCI69766. Zobacz pokrewny artykuł w Onkogennych rearanżacjach kierujących promieniowaniem jonizującym u człowieka.
[więcej w: grudziądz jednostka wojskowa, pijalnia wódki i piwa kraków, deli 8 ]
[przypisy: centrum tanich podręczników, deli 8, well done kraków ]