Identyfikacja onkogenów fuzji kinaz w raku tarczycy wywołanym promieniowaniem popromiennym ad 7

W przypadku rearanżacji RET / PTC, przebadano pod kątem niezrównoważonej ekspresji eksonów 12 i 13 w stosunku do eksonów 10 i 11 RET, które flankują wspólny punkt przerwania w intronie 11, za pomocą ilościowego RT-PCR (Suplementowa Figura 1). Próbki, w których ekspresja egzonów 12 i 13 była większa niż eksony 10 i 11, były amplifikowane parami starterów obejmującymi określone punkty przerwania we wszystkich znanych odmianach RET / PTC. Fuzje AKAP9-BRAF, PAX8-PPARG i NTRK1 badano przesiewowo za pomocą RT-PCR. Genomowy DNA analizowano również za pomocą spektrometrii mas Sequenom w celu zbadania mutacji w gorącym miejscu w genach raka tarczycy, w tym RET, NRAS, KRAS, HRAS, BRAF, PIK3CA i AKT1 (31). Dające sparowane końce biblioteki cDNA RNA-seq przygotowano przy użyciu zestawu do przygotowania próbki mRNA-Seq Sample v2 (Illumina). Pokrótce, RNA poli-A (+) oczyszczony z 2 .g całkowitego RNA fragmentowano przez inkubację w 94 ° C przez 5 minut w buforze do fragmentacji i stosowano do dwuniciowej syntezy cDNA. Po ligacji sparowanego końca adapter frakcję o wielkości 250 do 300 pz oczyszczono na żelu i zamplifikowano za pomocą 15 cykli PCR. Powstałe biblioteki poddano sekwencjonowaniu w parze z 75-bitowym odczytem w HiSeq 2000 (Illumina). Analizy bioinformatyczne Wykorzystaliśmy rakiety śnieżne v2.0 (14) do wykrywania zdarzeń fuzji i Varscan 2.3.2 (18) do wykrywania somatycznych SNV i obliczonej ekspresji genów za pomocą r-make (http://physiology.med.cornell.edu/faculty/ mason / lab / r-make /) dla wartości odczytu. Bardziej szczegółowy opis znajduje się w Dodatkowych metodach. Dane RNA-seq omówione w tej publikacji zostały zdeponowane w Gene Expression Omnibus (32) NCBI i są dostępne poprzez numer dostępu GEO Series GSE48850 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/ acc.cgi. acc = GSE48850). RT-PCR, PCR genomowy i sekwencjonowanie Sanger do walidacji zmian genetycznych Całkowity RNA (500 ng) poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy SuperScript III (Invitrogen). cDNA (odpowiadający 10 ng całkowitego RNA) lub 10 ng genomowego DNA poddano amplifikacji PCR przy użyciu Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen). Reakcje przeprowadzono w termocyklerze w następujących warunkach: 35 cykli w 95 ° C przez 30 sekund, 60 ° C przez 30 sekund i 72 ° C przez 30 sekund, z 5-minutowym końcowym wydłużeniem w 72 ° C . Gen kodujący GAPDH został zamplifikowany w celu oszacowania wydajności syntezy cDNA. Produkty PCR sekwencjonowano bezpośrednio w obu kierunkach stosując zestaw BigDye Terminator i sekwenator DNA ABI 3130xl (Applied Biosystems). Startery do PCR do wykrywania mutacji ETV6-NTRK3, AGK-BRAF, CREB3L2-PPARG i TSHR wymieniono w Tabeli dodatkowej 8. Efekty sygnalizacyjne ETV6-NTRK3 i AGK-BRAF Sklonowano cDNA dla ETV6-NTRK3 i AGK-BRAF. odpowiednio do pMSCVpuro i pLVX-AcGFP-N1 (Clontech). Komórki NIH3T3 transfekowano pustym wektorem, pMSCV-ETV6-NTRK3, pLVX-AcGFP-N1 lub pLVX-AGK-BRAF-GFP i traktowano 1,5 ug / ml puromycyny przez 2 tygodnie. Komórki COS7 przejściowo transfekowano pLVX-AcGFP-N1 lub pLVX-AGK-BRAF-GFP. Komórki inkubowano w wskazanych warunkach przez 48 godzin, a następnie poddano lizie w buforze zawierającym 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10% glicerolu, 1% Triton, 5 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2 i 20 mM Na4O7P2 suplementowane. z koktajlem inhibitora proteazy (Roche). Równe ilości całkowitego białka rozdzielono metodą SDS-PAGE, przeniesiono na membrany PVDF i poddano immunoblottingowi z następującymi pierwszorzędowymi przeciwciałami: p-ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204, 1: 1,000 (Cell Signaling); ERK1 (137F5), 1: 1000 (sygnalizacja komórkowa); p-MEK1 / 2 S217 / 221 (nr 9121S), 1: 1,000 (sygnalizacja komórkowa); MEK (nr 9122S), 1: 1,000 (sygnalizacja komórkowa); p-AKT S473 (D9E), 1: 1,000 (sygnalizacja komórkowa); p-AKT Thr308 (244F9), 1: 1,000 (sygnalizacja komórkowa); AKT (C2667), 1: 1,000 (sygnalizacja komórkowa); domena N-SH2 anty-PI3Kinaza-p85, 1: 1000 (Millipore); Cyklina Dl (92G2), 1: 1000 (sygnalizacja komórkowa); HA-Tag (C29F4), 1: 1,000 (sygnalizacja komórkowa); Heksokinaza I (C35C4), 1: 1,000 (sygnalizacja komórkowa); anty-ATP Synthase. (612518), 1: 1000 (BD Bioscience); BRAF (ab59357), 1: 1,000 (Abcam); i (3-aktynę (A2228), 1: 1,000 (Sigma-Aldrich). Prążki wizualizowano za pomocą ulepszonej chemiluminescencji (GE Healthcare Biosciences) zgodnie z zaleceniami producenta. Badania w lizatach mitochondrialnych. Połączoną 15 cm szalkę przemyto PBS, komórki odwirowano i osad ponownie zawieszono w ml lodowatego buforu HIM (200 mM mannitolu, 70 mM sacharozy, mM EGTA i 10 mM HEPES) uzupełnionego koktajl inhibitora proteazy (Roche), homogenizowany przy użyciu urządzenia Polytron, a następnie przepuszczony przez strzykawkę z igłami 20 G i 30 G (5 razy każdy). Następnie homogenaty odwirowano przy 700 g w temperaturze 4 ° C przez 10 minut (peletki, jądra komórkowe i nieuszkodzone komórki), a supernatant odwirowano przy 10 000 gw temperaturze 4 ° C przez 10 minut w celu zebrania ciężkiego osadu błony (supernatant, cytozol i światło). membrany)
[patrz też: globulki dopochwowe przeciwzapalne, kalkulator makroskładników, motochemia ]
[podobne: studio urody 11, vanilla komis, cukiernia michalscy ]