Dożywotnia ekspozycja na rozpuszczalny TGF- antagonista chroni myszy przed przerzutami bez niepożądanych skutków ubocznych czesc 4

Zebrano również surowicę i gruczoły sutkowe w celu oznaczenia poziomów SR2F za pomocą testu kanapkowego ELISA. Immunofenotypowanie. Całą krew pobierano od transgenicznych i dzikich myszy płci żeńskiej przez nakłucie serca, a pełną morfologię krwi i różnicę białych krwinek określał Ani Lytics Inc. (Gaithersburg, Maryland, USA). Aby określić liczbę komórek śledziony, śledziony wycięto i przerwano, a erytrocyty lizowano buforem do lizy ACK (BioWhittaker Inc., Walkersville, Maryland, USA). Sumaryczne komórki śledziony zliczono za pomocą hemocytometru, i zabarwiono je i analizowano za pomocą FACSCalibur przy użyciu oprogramowania CellQuest (Becton Dickinson and Co., San Jose, California, USA). W celu bezpośredniego wybarwienia w celu określenia całkowitego rozkładu leukocytów i ilościowego określenia fenotypów aktywowanych i / lub komórek T pamięci, zakupiono następujące skoniugowane przeciwciała z BD Pharmingen (San Diego, Kalifornia, USA): anty-CD69 FITC, anty-CD25 fikoerytryna (PE ), anty-CD62L FITC, anty-CD44 PE, anty-CD4 PerCP, allofikocyjanina (APC), anty-CD8 PerCP, anty-CD3 APC, anty-B220 APC, anty-NK1.1 PE, anty-CD11b FITC, i polietylen anty-Ly-6G (Gr-1). Przed barwieniem, receptory Fc blokowano przeciwciałem anty-CD16 / 32 (2,4G2; BD Pharmingen). Wyniki Walidacja antagonisty SR2F in vitro. Ludzka linia komórkowa raka sutka MDA MB435 była trwale transfekowana SR2F lub DNR jako kontrola pozytywna. Hamujący wzrost efekt TGF-a został w dużej mierze wyeliminowany w komórkach transfekowanych SR2F i został całkowicie zniesiony w komórkach transfekowanych DNR (Figura 1c). To pokazuje, że endogennie syntetyzowany SR2F jest zdolny do ochrony komórek przed biologicznym działaniem dodanego TGF-a. Niższa skuteczność SR2F w porównaniu z DNR prawdopodobnie odzwierciedla rozległe rozcieńczenie wydzielanego SR2F w pożywce hodowlanej. Stosując oczyszczone białko SR2F, ustaliliśmy, że stosunek 90: SR2F do TGF-pi jest wymagany do 90% neutralizacji aktywności biologicznej in vitro (Figura 1d). Jak wykazano wcześniej, SR2F może wiązać tylko TGF-ai i TGF-a3, a nie TGF-a2 (odnośnik 20 i nasze dane, niepokazane). Charakterystyka myszy transgenicznych MMTV-SR2F. Wysokopoziomową ekspresję mRNA SR2F obserwowano w gruczole sutkowym i gruczole ślinowym homozygotycznych transgenicznych samic linii MMTV-SR2F, z mniejszą ekspresją w tkance płucnej i limfoidalnej (Figura 2a). Hybrydyzacja in situ wykazała, że ekspresja mRNA SR2F w gruczole sutkowym była ograniczona do komórek nabłonka (Figura 2b). Ekstrakty transgenicznych gruczołów sutkowych wykazały pasmo oczekiwanej wielkości dla dimerycznego SR2F w Western blotach (Figura 2c). W teście ELISA wykryto białko SR2F na najwyższych poziomach (200. 1000 ng / g) w gruczołach sutkowych i męskich pomocniczych narządach płciowych dorosłych myszy, z niższymi, ale wykrywalnymi poziomami (30. 150 ng / g) we wszystkich innych narządach, z wyjątkiem mózg (figura 2d i dane nie pokazane). Obecność SR2F w narządach, takich jak nerki, które nie wykazują ekspresji mRNA SR2F, prawdopodobnie odzwierciedla sekwestrację z krążenia, ponieważ wysokie poziomy białka SR2F również znaleziono w surowicy (Figura 2d). Stężenia SR2F w surowicy były najwyższe u bardzo młodych myszy, ze względu na dodatkową obecność białka przenoszonego przez matki. Monitorując spadek poziomów SR2F w krążeniu w czasie w potomstwie heterogenicznych matek transgenicznych typu dzikiego, można obliczyć okres półtrwania in vivo dla białka SR2F wynoszącego 12,3. 0,5 dnia (rysunek 2e). Należy jednak zauważyć, że krążące poziomy SR2F u transgenicznych myszy były ogólnie utrzymywane na poziomie. 200 ng / ml przez cały okres życia zwierzęcia, z powodu syntezy endogennej (nie pokazano). Zdolność SR2F wytworzonego in vivo do wiązania się z TGF-a określono metodą sieciowania powinowactwa ligandu. 125I-TGF-a1 związany z identycznym prążkiem w transgenicznej surowicy i w surowicy typu dzikiego wzbogaconej oczyszczonym SR2F (Figura 2f). Natomiast TGF-. związane tylko z pasmem o wysokiej masie cząsteczkowej odpowiadającym a2-makro-globuliną w surowicy typu dzikiego. Wskazuje to, że SR2F wytworzony in vivo jest prawidłowo zwinięty i jest zdolny do wiązania TGF-a. o wyższym powinowactwie niż główne białko wiążące się z surowicą a2-makroglobulina, która jest obecna w dużym nadmiarze. Rysunek 2TGF-. ekspresja i funkcja antagonisty w myszy MMTV-SR2F. (a) Ekspresja mRNA SR2F w różnych tkankach. RNA przygotowano z transgenicznej myszy dorosłej dziewicy żeńskiej i sondowano pod kątem SR2F. (b) Specyficzna ekspresja SR2F typu komórkowego w gruczole sutkowym. Hybrydyzacja in situ wykazała swoistą ekspresję mRNA SR2F w komórkach nabłonka przewodów sutkowych (EC), ale nie w poduszce tłuszczowej sutka (FP) lub naczyniach krwionośnych (BV) dziewiczej myszy transgenicznej
[przypisy: kalkulator makroskładników, węglowodany złożone tabela, skierowanie do szpitala psychiatrycznego ]
[hasła pokrewne: pompon komis, pijalnia wódki i piwa kraków, trufla kraków ]