Dożywotnia ekspozycja na rozpuszczalny TGF- antagonista chroni myszy przed przerzutami bez niepożądanych skutków ubocznych cd

Opracowano czuły i specyficzny test ELISA do oznaczania ilościowego SR2F. Tkanki homogenizowano w buforze do ekstrakcji (1% Nonidet P40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4 i 20 ug / ml fluorku 4- (2-aminoetylo) -benzenosulfonylu) i klarowano. Płytki do mikromiareczkowania Nunc MaxiSorp (Nalge Nunc International, Rochester, Nowy Jork, USA) powlekano przez noc w temperaturze 4 ° C za pomocą .g / studzienkę koziej antyludzkiej IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pennsylvania, USA). Po płukaniu i blokowaniu za pomocą buforowanej Tris soli fizjologicznej (TBS) i kazeiny (BioFX Laboratories Inc., Owings Mills, Maryland, USA), próbki surowicy lub tkanki lub oczyszczony standard SR2F (1. 100 pg / studzienkę; R & D Systems Inc.) seryjnie rozcieńczone w TBS / kazeinie dodano do 1-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej. Przeciwciało wykrywające zawierało 12,4 ng / studzienkę biotynylowanego anty-TGF-a. receptor typu II (BAF241; R & D Systems Inc.). Barwę opracowano przy użyciu rozcieńczonej 1: 10 000 peroksydazy sprzężonej ze streptawidyną (016-030-084; Jackson ImmunoResearch Laboratories) z substratem peroksydazy (TMBW-0100-01; BioFX Laboratories Inc.). Analiza western blot i powinowactwo ligandów. W przypadku blotów typu Western blot, ekstrakty gruczołu sutkowego (20 .g / ścieżkę) od myszy typu dzikiego lub transgenicznych prowadzono na nieredukujących żelu Tris-glicynę w ilości 4 .12% i przenoszono na nitrocelulozę. Oczyszczone SR2F (2 ng / studzienkę) zastosowano jako kontrolę pozytywną. Bloty sondowano 0,2. G / ml anty-ludzkiego Fc przeciwciała (109-005-098; Jackson ImmunoResearch Laboratories), z lub bez nadmiaru ludzkiej IgG (5. G / ml) w celu wykazania swoistości przeciwciała. Do sieciowania powinowactwa ligandu zastosowano surowice z 3-miesięcznych myszy transgenicznych lub dzikich z pierwszego miesiąca, a oczyszczoną SR2F (2 ng / 0,1 ml) dodawano do surowicy typu dzikiego lub PBS jako kontrolę pozytywną. Dodano 125I-TGF-a1 (131 (Ci / g) do końcowego stężenia 0,4 nM, a mieszaninę reakcyjną inkubowano na lodzie przez godzinę. Disuccinimidylsuberate (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) dodano do końcowego stężenia mM i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usieciowane próbki przeprowadzono na 6% żelu Tris-glicyna w warunkach nieredukujących i wystawiono na działanie filmu. Test przerzutów w żyłach ogonowych. Izogeniczny przerzutowy amelanotyczny czerniak linii komórkowej 37-32, pochodzący z czerniaka powstającego w transgenicznej linii MH-37 HGF / SF, hodowano jak opisano wcześniej (27). Myszy płciowe typu transgenicznego i dobranego wiekiem (w wieku 2. 4 miesięcy) wstrzyknięto dożylnie 106 komórek w 0,1 ml DMEM przez żyłę ogonową. W jednym eksperymencie myszy uśmiercono 21, 28 i 35 dni po wstrzyknięciu (5. 10 myszy / grupę genotypu / punkt czasowy). W drugim eksperymencie oceniającym zależność skuteczności przerzutowej od poziomów SR2F użyto 4 . 5 myszy na grupę genotypową, przy czym wszystkie myszy poddano eutanazji po 35 dniach. Myszy badano rażąco podczas sekcji pod kątem obecności przerzutów w narządach wewnętrznych. Mikroskopowe oznaczanie ilościowe przerzutów przeprowadzono na reprezentatywnych przekrojach utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie krwi barwionej hematoksyliną i eozyną przez certyfikowanego patologa weterynaryjnego (MR Anver). W przypadku wątroby zbadano dwie sekcje każdego płata wątroby. Tumorogeneza u myszy MMTV-neu. Myszy homozygotyczne MMTV-neu [FVB / N-TgN (MMTV-neu) 202 Mul] uzyskano z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA) i skrzyżowano z myszami kontrolnymi FVB / NCr lub z myszami homozygotycznymi MMTV-SR2F w celu wygenerowania dwóch myszy. kohorty eksperymentalne, mające sam neukonen (29 myszy) lub oba neu i SR2F (38 myszy). Samice myszy poddawano cyklom przez jedną rundę ciąży i laktację w celu zwiększenia ekspresji transgenów. Myszy przesiewano co dwa tygodnie pod kątem nowotworów sutka i poddawano eutanazji, gdy jakikolwiek guz pierwotny osiągał średnicę 2 cm lub gdy mysz wydawała się chorobliwa. Objętość guza obliczono za pomocą wzoru V = LS × 0,4, gdzie L i S są najdłuższymi i najkrótszymi wymiarami, odpowiednio (28). Guzy, gruczoły sutkowe i płuca zebrano do analizy histologicznej i zebrano surowicę do oznaczenia poziomów krążących SR2F. Analiza fenotypów nieimmunologicznych. Kompletne badania przeprowadzono na 22 samicach myszy FVB / NCr i 20 samicach myszy SR2F + / + w wieku 16. 26 miesięcy, ze średnim wiekiem 20. 2 miesiące dla grupy FVB / NCr i 21. 4 miesiące dla grupy SR2F. Analizowano zarówno myszy pierwotne, jak i poporodowe. Podczas sekcji wszystkie myszy badano na obecność dużych zmian. Trzydzieści trzy narządy były rutynowo zbierane do obserwacji histologicznej, podobnie jak wszelkie dodatkowe tkanki z uszkodzeniami. Skrawki hematoksyliny i eozyny poplamione tkanką zatopioną w formalinie zostały zbadane przez patologa weterynaryjnego (MR
[podobne: trufla kraków, pompon komis, węglowodany złożone tabela ]
[patrz też: deccoria galerie, genji sushi, królestwo pierożka ]